甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体及其应用

本发明属于生物，涉及甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体及其应用。具体地，本发明涉及甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体，编码所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂的制备，以及甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体或甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂在催化还原果糖-6-磷酸制备甘露醇中的应用。

背景技术：

1、甘露醇是一种天然的功能性六元糖醇，最早发现存在于南瓜、蘑菇、洋葱、海藻等食材中。甘露醇与山梨醇一样，其代谢途径包括氧化为相应的酮糖或活性醛糖，或磷酸化成多羟基-1-磷酸盐。不过，糖醇的磷酸化作用只存在于微生物体内。人体吸收甘露醇后，通过果糖激酶的作用进入磷酸丙糖循环，无需胰岛素参与代谢，因此，甘露醇可以被视为低热量是食品添加剂，适用于糖尿病和肥胖患者。作为甜味剂，甘露醇不为口腔微生物提供营养，从而显著改善口腔健康，预防蛀牙。在医药领域，甘露醇是降低组织水肿和利尿排水的重要药物，具有脱水、清除氧自由基、降低血液粘度、改善微循环等作用，其主要功效包括降低颅内压、眼内压以及治疗肾病。此外，甘露醇稳定性较高，不与其他药物发生反应，可用作药物的赋形剂和填充剂。在工业领域，甘露醇的羟基在特定条件下可参与多种化学反应。它可用于制作塑料，用于保温和消防，并可作为纤维、烟草等的工业助剂。

2、目前，提取法是我国生产甘露醇的主要方法之一。该法可得到单一的甘露醇，精制程度高，但收率低，精制工序繁琐，生产成本高且原料来源受限制；与之相比，蔗糖水解转化是目前实际生产中最为实用、有效的生产方法。以廉价易得的蔗糖为原料氢化制备甘露醇，工艺可靠，提取精制容易，成本低且产品质量好。然而，该方法的催化氢化条件较高，产物中山梨醇含量偏高，需要进一步的分离纯化步骤。此外，甘露醇还可以通过微生物发酵生产。这种方法的特点是反应条件温和，底物选择性高。通过优化条件，甘露醇的产量和浓度都可以得到有效提高。例如，gaspar等人敲除了mtla和mtlf基因，产生了食品级乳酸脱氢酶缺陷型乳酸乳杆菌(l.lactis)突变体，这些菌株能以低产量从葡萄糖中生产甘露醇。meng等从甘蔗汁中分离出一株新型假丝酵母菌株(sk26.001)，它可以在不添加果糖的情况下从高浓度葡萄糖中生产甘露醇，通过优化条件，甘露醇的浓度可以达到68.5g/l。尽管如此，发酵的培养基成分较复杂，发酵途径中的代谢副产物(例如乙酸盐、乳酸盐等)较多，而且只有当其他优选碳源可用时，甘露醇才可以积累，代谢调控比较复杂。

3、酶作为生物催化剂，在生物合成中发挥着关键作用。目前已经建立了一条从淀粉出发体外酶法催化合成甘露醇的路线。该反应途径是基于同型发酵乳酸菌的甘露醇生产途径以及先前设计的完全利用淀粉出发合成功能性糖醇，其中核心步骤涉及六种关键催化酶元件。这些关键酶催化的反应可以在一个锅内以辅因子和磷酸盐平衡的方式同时进行。而线路中的甘露醇磷酸脱氢酶是一种来自中温宿主的蛋白质，研究表明增强酶的热稳定性有助于提高整条反应线路的温度，降低反应过程中被微生物污染的概率。此外，利用热沉淀纯化蛋白的方式可以有效去除反应液中的杂质和不相关蛋白质，提高系统的传质和反应效率，进一步简化工业体外合成甘露醇的步骤，提高产品收率和质量。

4、然而现有技术中甘露醇-1-磷酸脱氢酶存在着热稳定性差、催化活性较低的问题。

技术实现思路

1、为克服现有技术中甘露醇-1-磷酸脱氢酶存在的热稳定性差、催化活性较低的问题，本发明提供甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体及其应用。

2、具体地，本发明涉及甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体，编码所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂的制备，以及甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体或甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂在催化还原果糖-6-磷酸制备甘露醇中的应用。

3、本发明通过蛋白质工程改造，提供一种具有高催化活性且热稳定性显著提高的甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体，编码所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂的制备，以及甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体或甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂在催化还原果糖-6-磷酸制备甘露醇中的应用。

4、基于本发明的方案，使用甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体作为催化剂，高效催化果糖-6-磷酸还原，合成甘露醇-1-磷酸，实现酶法合成甘露醇。

5、本发明的甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体热稳定性高，可以实现热沉淀纯化目的蛋白，从而极大地简化酶蛋白质的分离，提高酶促反应的效率。

6、本发明通过对蛋白质结构进行理性设计，提供了一种热稳定性显著提高的甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体，提高其热稳定性使其在工业方面更有效利用，拓展了其在甘露醇生产的方面的实际应用价值。

7、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

8、本发明的技术方案之一：提供一种热稳定性显著提高且保持高催化活性的甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体。

9、所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体是以前期筛选到的甘露醇-1-磷酸脱氢酶m1pdh的氨基酸序列为基础，采用借助计算机的半理性设计和定向进化结合的策略对m1pdh进行热稳定性的改造获得的，是在如seq id no.2所示的氨基酸序列中经过取代一个或几个氨基酸形成的热稳定性提高的衍生蛋白质。

10、在本发明的一个实施方式中，所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体选择如下氨基酸序列对应的蛋白质：

11、(1)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为苯丙氨酸；

12、(2)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为酪氨酸；

13、(3)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第133位的组氨酸替换为酪氨酸

14、(4)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第133位的组氨酸替换为亮氨酸；

15、(5)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为苯丙氨酸，第133位的组氨酸替换为亮氨酸；

16、(6)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为酪氨酸，第133位的组氨酸替换为亮氨酸；

17、(7)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为酪氨酸，第133位的组氨酸替换为酪氨酸；

18、(8)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为苯丙氨酸，第133位的组氨酸替换为酪氨酸；

19、(9)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为苯丙氨酸，第133位的组氨酸替换为酪氨酸，第157位的缬氨酸替换为异亮氨酸；

20、(10)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为苯丙氨酸，第133位的组氨酸替换为酪氨酸，第157位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第49位组氨酸替换成精氨酸；

21、(11)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为苯丙氨酸，第133位的组氨酸替换为酪氨酸，第157位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第49位组氨酸替换成精氨酸，第367位天冬酰胺替换成异亮氨酸；

22、(12)将如seq id no.2所示氨基酸序列的第180位的丝氨酸替换为苯丙氨酸，第133位的组氨酸替换为酪氨酸，第157位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第49位组氨酸替换成精氨酸，第367位天冬酰胺替换成异亮氨酸，第103位谷氨酰胺替换成亮氨酸。

23、本发明的技术方案二：提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体。

24、本发明的技术方案三：提供一种重组表达载体，包含编码所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的核酸。

25、所述的重组表达载体为通过本领域常规的方法将所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体核酸克隆到各种表达载体上而获得。所述的表达载体包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、噬菌体或是病毒载体等，优选质粒pet-28a(+)。

26、本发明的技术方案四：提供一种包含所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体核酸或所述重组表达载体的重组表达转化体。

27、所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的本发明的甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。将所述重组表达载体转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，即可获得本发明优选的重组表达转化体。其中所述的转化方法为本领域常规方法，如热激法、电转法等，更优选的为热激法。

28、本发明的技术方案五：提供一种甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的制备方法。

29、本发明所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的制备方法较优为：培养如上所述的重组表达转化体，分离获得重组表达的甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体。其中所述的培养重组表达转化体所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的培养基。所述培养基优选lb培养基，其配方为：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 10g/l，ph 7.0。培养方法和培养条件等可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体即可。

30、重组表达转化体培养的具体操作可按本领域常规操作进行。优选本发明所述的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的lb培养基中，37℃培养，当培养液的od600达到0.5～1.0时，加入终浓度为0.1～0.5mmol/l的β-d异丙基-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)进行诱导，在16℃继续培养24h，即可高效表达本发明所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体。培养结束后，离心收集沉淀的菌体细胞，即为重组表达转化体的静息细胞；将所得细胞悬浮于tris缓冲液(tris-hcl,200mmol/l,ph 7.5)中，超声破碎，破碎液离心，收集上淸液，即可获得所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的粗酶液。

31、本发明的技术方案六：提供一种甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂，是以下形式中的任意一种：

32、(1)培养所述重组表达转化体，分离含有甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的转化体细胞；

33、(2)对含有所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得含有所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的细胞破碎液即粗酶液；

34、(3)将含有所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体的细胞破碎液进行纯化得到纯酶液。

35、本发明中提供了酶的比活检测：利用紫外-可见分光光度计测定甘露醇-1-磷酸脱氢酶的活力，通过检测nadh在340nm处吸光值的变化来计算。测活体系为1ml，包括970μl的tris-hcl缓冲液(200mm，ph 7.5)，10μl的底物果糖-6-磷酸(100mm)，10μl的nadh(15mm)，10μl的酶液(稀释到合适浓度)。体系中所有物质依次加入到比色皿中，混合均匀后放入紫外分光光度计中，在30℃下测定吸光值变化。酶活力的单位定义为，每分钟内氧化1μmol的nadh所需要的酶量。酶活计算公式如下：

36、酶活力(u)＝ew×v×103/(6220×l)

37、式中，ew为1分钟内340nm处吸光度的变化；v为反应液的体积，单位为ml；6220为nadh的摩尔消光系数，单位为l/(mol.cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(u)对应于上述条件下每分钟催化lμmol nadh氧化所需的酶量。

38、本发明采用的技术方案七：使用如上所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体或所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂催化果糖-6-磷酸还原合成甘露醇-1-磷酸的应用。

39、其中所述的果糖-6-磷酸的结构如下所示：

40、

41、以果糖-6-磷酸还原合成甘露醇-1-磷酸，以甘露醇-1-磷酸脱氢酶m1pdh、甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体或甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂与葡萄糖脱氢酶bmgdh偶联从而实现nadh的辅酶循环，示意图如图1所示。

42、所述的不对称还原反应的条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择较佳的，所述的应用包括下述步骤：将甘露醇-1-磷酸脱氢酶(或甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体或甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂)与葡萄糖脱氢酶的粗酶冻干酶粉加入反应缓冲液中，加入底物、葡萄糖以及nad+，在50℃下混合反应。所述甘露醇-1-磷酸脱氢酶(或甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体或甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体催化剂)与底物果糖-6-磷酸的用量比较佳的为5ku/mol～10ku/mol底物，葡萄糖与果糖-6-磷酸的比较佳用量为200g/mol～300g/mol。反应缓冲液为实验室常规缓冲液，ph范围在5.5～7.0，优选为tris-hcl缓冲液，浓度较佳的为0.1～0.2mol/l，额外添加的nad+的用量以0～0.2mmol/l较佳。反应温度较佳的为50℃，反应过程以在搅拌条件下进行较佳。反应过程中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以底物完全转化或反应转化率停止增长的时间为准，一般为1～24h。由于液相色谱无法对产物甘露醇-1-磷酸进行检测，因此利用级联一步甘露醇-1-磷酸脱磷酶对其进行脱磷酸根反应生成甘露醇，利用液相色谱法检测甘露醇的含量，反应转化率利用甘露醇的含量进行分析。

43、待还原反应结束后，反应液用等量500mm硫酸试剂停止反应，经水系膜过滤。

44、其中，甘露醇-1-磷酸是合成甘露醇的关键中间体。

45、与现有技术相比，本发明的创新和改进效果在于：

46、本发明的甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体具有高催化活性、显著提升的热稳定性的优势。最优突变体可在50℃内转化50g/l的底物，转化率与母本在37℃时的转化率相当，所得产物均为甘露醇-1-磷酸。

47、因此本发明的甘露醇-1-磷酸脱氢酶突变体在催化果糖-6-磷酸还原时，可以将50℃作为反应温度，避免甘露醇制备中微生物的污染，在甘露醇的工业生产中具有良好的应用前景。