一种优化的鹿专用体外受精液的配制方法与流程

本发明属于体外受精，具体的说是一种优化的鹿专用体外受精液的配制方法。

背景技术：

1、鹿是偶蹄目鹿科的哺乳动物，在我国的东北地区是主要的养鹿区域，也是当地十分重要的农业经济，目前可用于鹿(主要指梅花鹿和马鹿)体外胚胎生产的受精液主要有talp液、sof液和dsof液三种；其中dsof液是鹿专用体外受精液，是通过对马鹿受精过程中输卵管液的分析而得出的，其在鹿的体外胚胎生产上效果要远好于talp液和sof液，由于该液的原始配方由于所用的氨基酸均为单独的氨基酸，较为分散，配液过程十分繁琐。

2、在后续的研究中人们对其进行了改良，改良后的dsof液用包含了多种非必须氨基酸的mem neaas液和多种必须氨基酸的bme aas液对原始配方中的多种单独氨基酸进行了替换，进而优化了配液程序；改良后的dsof液同时提高了丙酮酸的含量，并用肝素替换了20％绵羊血清作为精子的获能因子。

3、在使用中，上述改良后的dsof液对我国繁殖季节梅花鹿进行了体外胚胎生产试验，结果受精卵仅发育到2-cell阶段便停滞了，卵裂率也仅为22％(2/9)。而相比之下，对照组sof液(20％绵羊血清作为精子的获能因子)的卵裂率达到了67％(2/3)，且有一个受精卵发育到了8-cell阶段；这表明上述改良后的dsof液并不适用我国鹿的体外胚胎生产，因此，针对上述问题提出一种优化的鹿专用体外受精液的配制方法。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，解决背景技术中所提出的至少一个技术问题。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明所述的一种优化的鹿专用体外受精液的配制方法，该方法包括以下步骤：

3、s1、针对dsof液进行保存液的配置；

4、s1.1、配制浓度为0.0083g/ml的mgso4，1ml分装，于-20℃中冻存；

5、s1.2、配制浓度为0.0301g/ml的cacl2·2h2o，1ml分装，于-20℃中冻存；

6、s1.3、配制浓度为0.0036g/ml的丙酮酸(pyruvate)，1ml分装，于-20℃中冻存；

7、s1.4、配制浓度为0.0292g/ml的谷氨酰胺(l-glutamine)，1ml分装，于-20℃中冻存；

8、s1.5、配制每毫升含0.0075g青霉素和0.0050g链霉素的混合液，1ml分装，于-20℃中冻存；

9、s1.6、配制浓度为20μg/ml的亚牛磺酸，50μl分装，于-20℃中冻存；

10、s1.7、配制浓度为5μg/ml的肝素，50μl分装，于-20℃中冻存；

11、s2、基础液的配制；

12、s2.1、用万分之一的分析天平，秤取100mm nacl、6mm kcl、1.5mm ca-lactate和25mm nahco3于20～40ml的电导率为18.2ω的超纯水中进行溶解。然后倒入100ml的容量瓶中，依次加入100μl酚红、1ml冻存的丙酮酸、1ml冻存的谷氨酰胺、1ml冻存的青链霉素混合液、1ml非必须氨基酸、2ml必须氨基酸、1ml冻存的mgso4和1ml冻存的cacl2·2h2o，用超纯水定溶后反复颠倒容量瓶10～20次。最后用0.22um的滤器进行过滤，于4℃环境下保存备用(不超过6个月)；

13、s3、使用液的配制(以20ml使用液为例)；

14、s3.1、用万分之一的分析天平，秤取20mg bsa,注入16ml基础液进行溶解，然后依次加入4ml绵羊血清(或发情绵羊血清)、50μl冻存的亚牛磺酸和50μl冻存的肝素进行充分混合；混合后用0.22um的滤器进行过滤形成使用液，从而得到优化dsof液；该使用液可于4℃环境下保存7天。

15、2.根据权利要求1所述的一种优化的鹿专用体外受精液的配制方法，其特征在于：所述该优化dsof液继续用mem neaas液和bme aas液替代了多种单独氨基酸，比原始配方更加简洁，大大缩短了配液程序及对节省了试剂开支；所述该优化dsof液在上述改良dsof液的基础上继续用20％绵羊血清作为精子的获能因子，使用20％绵羊血清作为获能因子后可用于我国鹿的体外胚胎生产，梅花鹿的体外受精卵至少可发育到桑葚胚阶段，卵裂率也提高到了50％以上；所述该优化dsof液提高了亚牛磺酸浓度到20μg/ml，比原始配方、上述改良dsof液和其他受精液的精子活率效果更好；所述该优化dsof液提高了肝素浓度到5ug/ml，在体外受精18h直线运动精子率的检测统计上，其效果要比上述中dsof液+20μg/ml亚牛磺酸的效果好。

16、本发明的有益效果是：

17、1.本发明提供一种优化的鹿专用体外受精液的配制方法，通过对改良后的dsof液进行了进一步的优化研究，最终形成了优化dsof液，相较于改良dsof液，本优化dsof液比原始配方dsof液更加简洁，大大缩短了配液程序及对节省了试剂开支，同时增加了在体外受精18h精子活率，使得梅花鹿的体外受精卵至少可发育到桑葚胚阶段，卵裂率也提高到了50％以上。

技术特征：

1.一种优化的鹿专用体外受精液的配制方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种优化的鹿专用体外受精液的配制方法，其特征在于：所述该优化dsof液继续用mem neaas液和bme aas液替代了多种单独氨基酸，比原始配方更加简洁，大大缩短了配液程序及对节省了试剂开支；所述该优化dsof液在上述改良dsof液的基础上继续用20％绵羊血清作为精子的获能因子，使用20％绵羊血清作为获能因子后可用于我国鹿的体外胚胎生产，梅花鹿的体外受精卵至少可发育到桑葚胚阶段，卵裂率也提高到了50％以上；所述该优化dsof液提高了亚牛磺酸浓度到20μg/ml，比原始配方、上述改良dsof液和其他受精液的精子活率效果更好；所述该优化dsof液提高了肝素浓度到5ug/ml，在体外受精18h直线运动精子率的检测统计上，其效果要比上述中dsof液+20μg/ml亚牛磺酸的效果好。

技术总结本发明属于体外受精技术领域，具体的说是一种优化的鹿专用体外受精液的配制方法，该方法包括以下步骤：S1、针对DSOF液进行保存液的配置；S1.1、配制浓度为0.0083g/mL的MgSO4，1mL分装，于‑20℃中冻存；S1.2、配制浓度为0.0301g/mL的CaCL2·2H2O，1mL分装，于‑20℃中冻存；S1.3、配制浓度为0.0036g/mL的丙酮酸(pyruvate)，1mL分装，于‑20℃中冻存；S1.4、配制浓度为0.0292g/mL的谷氨酰胺(L‑Glutamine)，1mL分装，于‑20℃中冻存；通过对改良后的DSOF液进行了进一步的优化研究，最终形成了优化DSOF液，相较于改良DSOF液，本优化DSOF液比原始配方DSOF液更加简洁，大大缩短了配液程序及对节省了试剂开支，同时增加了在体外受精18h精子活率，使得梅花鹿的体外受精卵至少可发育到桑葚胚阶段，卵裂率也提高到了50％以上。技术研发人员：赵刚,黄承俊,李宁,杜学海,江馗语,马力,商业受保护的技术使用者：辽宁省农业发展服务中心技术研发日：技术公布日：2024/8/1