一种低温生淀粉糖化酶产生菌筛选方法

本发明属于微生物工程领域，本发明涉及一种低温生淀粉糖化酶产生菌筛选方法。

背景技术：

1、生淀粉糖化酶属于淀粉酶，是指可直接消化未经糊化的生淀粉颗粒的一类酶。由于天然淀粉颗粒的多晶结构，传统发酵需要经过液化、糖化等步骤才能将其降解为葡萄糖。这主要涉及高温条件下α-淀粉酶和糖化酶的水解，即在大约100℃下依次将生淀粉糊化，在大约95℃下用嗜热α-淀粉酶液化，并在50～60℃下使用糖化酶处理。显然，现有的淀粉加工技术是能源密集型的，高温下淀粉酶解需要大量能量输入和额外设备，这导致淀粉衍生商品的生产成本增加。与目前工业上广泛应用的淀粉酶相比，生淀粉糖化酶可在较低的温度下，直接分解未糊化的生淀粉晶体颗粒，将传统工艺的淀粉蒸煮、糊化、糖化多步合并为一步直接糖化，对生淀粉的降解能力更强，属于高效节能酶。

2、目前生淀粉糖化酶菌株主要通过透明圈筛选法进行筛选，但该方法需要使用碘液，碘液是一种消毒剂，虽然在使用时可能经过稀释，但仍有可能对菌株的生长和代谢产生抑制作用。这可能导致一些潜在的有价值菌株在筛选过程中被错误地判定为阴性；此外，透明圈的大小和清晰度可能受到多种因素的影响，如培养基的成分、培养条件、菌株的活性等，透明圈的观察和测量结果可能存在一定的主观性，导致筛选结果的准确性受到影响。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供一种低温生淀粉糖化酶产生菌筛选方法，仅通过无碘液添加透明圈初筛结合酶活及扫描电镜复筛即可成功筛选生淀粉糖化酶产生菌株。不仅可以有效避免碘液对菌株的不利影响，防止一些潜在有价值的菌株因碘液反应而被错误地判定为阴性。还能更准确地识别和筛选出具有生淀粉糖化酶产生能力的菌株，从而提高筛选的效率和准确性。这种方法在微生物筛选和酶工程领域具有一定的应用价值和发展潜力。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种低温生淀粉糖化酶产生菌筛选方法，具体步骤如下：

4、步骤一、无碘液添加透明圈初筛

5、平板初筛培养基成分g/l：玉米生淀粉20，酵母膏5，蛋白胨5，磷酸氢二钾1.5，七水硫酸镁0.5，氯化钾0.7，七水硫酸亚铁0.02，琼脂20，ph 6.0，121℃，灭菌20min，然后在50℃左右无菌操作加入生玉米淀粉。

6、将处理的菌悬液进行富集，25℃，150r/min，振荡培养24h。取1ml的菌液，用无菌水进行系列梯度稀释，充分混匀，分别取稀释后菌悬液涂布于初筛培养基上，于25℃条件下培养并时刻观察其生长状态，当培养基上出现透明圈后，分离纯化不同形态且透明圈大的菌株。

7、步骤二、酶活及扫描电镜复筛

8、摇瓶复筛培养基成分g/l：玉米生淀粉40，蛋白胨10，酵母浸粉10，k2hpo40.5，mgso4.7h2o 0.5，nacl 0.5，kcl 0.5，ph 6.0，121℃，灭菌20min，然后在常温下无菌操作加入生玉米淀粉。

9、挑取纯化后的单菌落接种于50ml种子培养基中，25℃、150r/min条件下培养24h，获得种子液。种子液以1vt％的接种量转接于发酵培养基，25℃、150r/min发酵48h，通过酶活检测及扫描电镜观察生淀粉水解情况进行复筛。

10、酶活检测方法：发酵液于4℃下8000r/min离心10min，取上清液为粗酶液。于25ml圆底离心管中加入1.0ml 2％(w/v)的生玉米淀粉悬浮液，生玉米淀粉悬浮液由0.1mol/lph6.0的na2hpo4-kh2po4缓冲液配制，25℃预热10min。加入5.0ml的酶液，25℃、150r/min恒温振荡反应1h，加入0.5ml 4％naoh溶液终止反应，取粗酶液测定还原糖量，并计算发酵液的酶活(u/ml)；筛选得到低温生淀粉糖化酶产生菌。

11、本发明与现有技术相比的有益效果是：

12、仅通过无碘液添加透明圈初筛结合酶活及扫描电镜复筛即可成功筛选生淀粉糖化酶产生菌株，可有效避免添加碘液对菌株产生不利作用，同时扫描电镜复筛可清楚观察到生淀粉颗粒水解情况，能更准确地识别和筛选出具有生淀粉糖化酶产生能力的菌株，从而提高筛选的效率和准确性。这种方法在微生物筛选和酶工程领域具有一定的应用价值和发展潜力。

技术特征：

1.一种低温生淀粉糖化酶产生菌筛选方法，其特征是，具体步骤如下：

技术总结本发明属于微生物工程领域，公开了一种低温生淀粉糖化酶产生菌筛选方法。仅通过无碘液添加透明圈初筛结合酶活及扫描电镜复筛即可成功筛选生淀粉糖化酶产生菌株。不仅可以有效避免碘液对菌株的不利影响，防止一些潜在有价值的菌株因碘液反应而被错误地判定为阴性。还能更准确地识别和筛选出具有生淀粉糖化酶产生能力的菌株，从而提高筛选的效率和准确性。这种方法在微生物筛选和酶工程领域具有一定的应用价值和发展潜力。技术研发人员：迟乃玉,张庆芳,王严,迟雪梅,刘春莹受保护的技术使用者：大连大学技术研发日：技术公布日：2024/8/1