适用于单根毛干的mRNA多态性检测试剂盒

本发明属于法医学，涉及通过检测毛干mrna分子上的snp进行个体识别的试剂盒，特别是涉及一种适合于单根毛干的mrna多态性检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、毛发是各种犯罪现场最常见的法医学生物检材之一。组织学上可以将毛发分为两部分，一部分是由皮肤所覆盖的毛根和毛干组成的活细胞区域，另一部分则是由皮肤外的毛干构成的死细胞区域。毛发有着固定的生长周期，即毛发从生长到脱落的一系列重复循环过程。其中，毛囊的生长阶段被称为生长期，随后的退行阶段和静止阶段分别被称为退行期和静止期。

2、处于生长期的毛囊能为法医dna鉴定提供可靠的证据信息，然而犯罪现场发现的毛发大多是没有附着任何毛根细胞的静止期毛发。在角质化过程中，静止期毛发中的dna被破坏。此外，在大多数的法医案件中，检案人员往往难以判断不同毛发是否来自相同嫌疑人，为了避免可能出现的混合斑，仅提供单根毛发进行检测分析更优，但单根毛发能提供的遗传信息有限，从而严重限制了静止期毛发的str分型成功率，使静止期毛发的dna分型效果难达预期。

3、线粒体dna（mtdna）和蛋白质已被应用于毛干分析中。研究表明，毛干中的mtdna可以提供相关祖先的信息。然而，mtdna母系遗传的特性，限制了其在个体识别方面的应用，仅可为排除家系提供依据。蛋白质在毛干中占比较高（65～90%），利用蛋白质对毛干进行分析能达到较好的灵敏度，mason等（development of a protein-based humanidentification capability from a single hair[j].  j forensic sci, 2019, 64(4):1152-1159.）和吴佳蕾等（establishment of single amino acid polymorphismdetection method for hair shaft and individual identification application ineast asian population[j].  progress in biochemistry and biophysics, 2022, 49(9): 1774-1784.）便利用了基因变异肽（gvps）和单氨基酸多态性（saps）等来源于蛋白质的遗传信息进行个体识别。然而，基于“gvp-sap-nssnp”的个体识别存在一些固有的局限性，如蛋白质消化问题、nssnp推断不准确、批量效应等。因此，mtdna和蛋白质分析均不能满足法医学利用毛干，尤其是利用单根毛干进行个体识别的需求。

4、近年来，许多研究将rna用于法医检材鉴定，rna上的多态性信息也被应用于个体识别以及混合斑分析。rna也是毛干分析领域一种很有应用前景的生物标志物，2011年tochio等（presence of amplifiable mrna in acellular hair shafts: utilizationto analyze gene expression profiles of black and white hairs[j].  int j  dermatol, 2011, 50(5): 530-534.）的研究证实了mrna在毛干中的存在，gloria等（thepost-apoptotic fate of rnas identified through high-throughput sequencing ofhuman hair[j].  plos one, 2011, 6(11): e27603.）进一步证明了在毛发的凋亡过程中，rna的降解效率非常低。

5、cn 117305467a基于snapshot平台成功构建了一个包含11个毛干mrna基因上18个csnp分子标记的毛干rna分型体系，其累计个体识别概率达到0.999969，初步为使用毛干进行准确个体识别提供了策略。但是该分型体系需要至少五根毛干才能获得完整的基因分型结果，而在大多数场景中，检案人员在现场可能无法采集到多根毛发；此外，现场采集到的不同毛发是否来自同一人也无从考证，贸然使用该分型体系检测，存在获得混合分型的风险。

6、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（maldi tof-ms）是一种依赖于核酸序列的物理特性-质荷比进行snp分型的方法，其只需要根据a、t、c、g这4种碱基分子的质量差异，就可以在谱图上直观得到检测结果，具有高灵敏度、高精确度和高通量等优势，是当前公认的snp分型金标准之一。因此，利用该技术有望建立高灵敏度个体识别方法，大大提高检测单根毛干中多个snp的可能性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种适用于单根毛干的mrna多态性检测试剂盒，以能够在单根毛干上获得完整分型，使单根毛干能用于法医学个体识别，规避了使用多根毛干获得混合分型的风险。

2、为实现上述发明目的，本发明从文献中筛选已报道的共表达毛干mrna基因，使用数据库在毛干基因编码转录本上筛选maf＞0.1的多态性较好的snp位点，最终筛选出以下25个snp位点：rs1047449、rs10781358、rs112261068、rs12451652、rs201017624、rs2241726、rs2296744、rs2297208、rs3826543、rs500079、rs743686、rs7800753、rs923935、rs1047448、rs12937519、rs13046903、rs13070515、rs3657、rs486903、rs527、rs556052、rs7216017、rs72625995、rs76514540、rs9682540。

3、具体地，上述25个snp位点位于以下18个毛干mrna基因上：krt31、rfk、krt86、krt35、pabpc1、kmt2d、lemd2、tbc1d4、ctc1、ppp1r15a、rbm33、lrrc15、krt33a、krtap12-2、krt81、ahnak、krtap4-8、flg2。

4、本发明所述的18个毛干mrna基因以及25个snp位点具体见表1。

5、

6、在此基础上，本发明构建了一种适用于单根毛干的mrna多态性检测试剂盒，在所述试剂盒中含有seq id no.1～50所示的25对特异性多重pcr引物对，以及seq id no.51～75所示的25个snp单碱基延伸引物，用于对应检测上述来自于18个毛干mrna基因上的25个snp位点。

7、进一步地，可以将所述25对特异性多重pcr引物对分布于两个多重pcr体系中，其中多重pcr体系i中包含用于检测上表中前13个snp位点的引物对，多重pcr体系ii中包含用于检测上表中后12个snp位点的引物对。

8、本发明通过联合多重pcr技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法，提供了一种检测单根毛干mrna分子上的25个snp的检测方法，该方法能成功在单根毛干上获得完整分型，使单根毛干也能用于法医学个体识别，规避了使用多根毛干获得混合分型的风险。所述方法具体包括：

9、1）、提取待测单根毛干样本的rna作为模板，逆转录为cdna，利用所述seq id no.1～50所示的25对特异性多重pcr扩增引物对，通过多重pcr制备扩增产物；

10、2）、对纯化后的扩增产物，利用所述seq id no.51～75所示的25个snp单碱基延伸引物，通过单碱基延伸体系得到延伸产物；

11、3）、使用massarray质谱仪对延伸产物进行质谱检测和结果分析。

12、本发明所述的检测试剂盒和检测方法并非是用于疾病的诊断，而是可以应用于毛干检材，特别是单根毛干检材的法医学鉴定或检测。

13、本方法首次实现了使用单根毛干mrna多态性进行个体识别，克服了以往研究中需要提供大量毛发用于鉴定以及由此产生的混合斑解析的问题。

14、本方法在对单根毛干进行鉴定时，可实现室温下放置390天毛干的检测，同时也可实现对近发尾端毛发、白发和烫染毛发等多种类型毛发的检测，证明了本发明方法对法医现场各类毛发的应用性较强。

15、鉴于毛干主要是角化组织，多由死细胞组成，本发明构建的检测体系可为其他无核样品的检测提供参考，为法医降解样本的检测提供新思路。