一种地锦草来源细胞外囊泡分离提取方法与应用

本发明属于分子生物学及生物医学，具体地说是一种地锦草来源细胞外囊泡分离提取方法与应用。

背景技术：

1、地锦草(拉丁学名：euphorb ia hμmifusa wi l l d.ex sch l td l.)，是大戟科大戟属一年生草本植物，在我国分布广泛，资源丰富，作为我国传统药材，其具有悠久的药用历史。现代药理和临床研究表明，地锦草中含有黄酮类成分芹菜素、槲皮素、木犀草素等，含有鞣花酸等多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、保护肝肾、免疫调节和强效抗病毒作用。近年来，地锦草因其多种药理活性而成为健康促进和辅助治疗的热门产品，提取的药品和食品数量明显增加，其市场需求和应用领域不断扩大。

2、植物细胞外囊泡(extrace l l u l ar ves i c l es，evs)是由植物细胞分泌的一种重要结构，其基本骨架由脂质双层构成，内部包裹着各种活性物质，如蛋白质和核酸，具有磷脂双层封闭囊泡结构，在细胞间通信中起着重要作用(参考文献4：赵梦，李思敏，张蕾，等.植物来源囊泡及其生物医学应用研究进展[j].药学学报，2021，56(08)：2039-2047+2036.)。植物细胞外囊泡可以作为一种将多种信息(如：糖类、蛋白质、脂质、rna、代谢物等)从供体细胞传输到受体细胞的载体，一旦被受体细胞识别，便通过evs表面分子或内吞途径将信息传递到细胞内，进而激活受体细胞内的信号转导。evs具有克服合成纳米颗粒常见的潜在毒性和有限生产规模等限制的额外益处，代表了一种新的药物天然递送机制，可用于搭载药物或者组装小分子药物从而治疗、预防疾病。地锦草来源的细胞外囊泡内含多种中药活性物质，可克服合成纳米颗粒仅作为搭载体而无活性有效成分的缺陷，且从天然绿色植物中进行提取，因而有着更好的生物相容性和低毒副性。

3、目前，尚未见到有报道地锦草细胞外囊泡的提取方法。现有的植物来源细胞外囊泡提取技术需要多步超速离心，处理大规模细胞外囊泡提取耗时长，且浓缩率及回收率很低；此外，重复多次的离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。这些都限制了地锦草细胞外囊泡的大规模提取。

4、为此，本领域技术人员提出了一种地锦草来源细胞外囊泡分离提取方法与应用来解决背景技术提出的问题。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供一种地锦草来源细胞外囊泡分离提取方法与应用，以解决现有技术中目前地锦草细胞外囊泡分离提取技术的空白。本发明提供的技术方案采用一步低速离心结合300kda超滤浓缩即可实现对地锦草细胞外囊泡的粗提取，使得细胞外囊泡在较少离心次数、较低转速和一步超高速离心操作下即可得沉淀，简化了离心步骤；应用碘化乙二醇替换蔗糖溶液进行密度梯度离心，对提取到的地锦草细胞外囊泡进行分离纯化，相较于蔗糖，碘化乙二醇具有更为均匀的密度分布，可以更精确地分离不同密度的细胞外囊泡；使用硫酸葡萄糖胺溶液作为细胞外囊泡的保护剂，进行真空冷冻干燥，使得提取的细胞外囊泡稳定性好，适合工业大规模生产。此外，本发明提供的技术方案可通过紫外光分光光度计对地锦草细胞外囊泡中的蛋白质含量进行定量、通过纳米颗粒跟踪分析技术对一定体积中的囊泡个数进行统计，解决了传统草药治疗存在剂量不确定的问题；运用细胞培养模型评估地锦草胞外囊泡对细胞的潜在毒性和损伤程度，以评定囊泡的安全性及毒副作用。综上，本发明旨在解决传统草药治疗存在剂量不确定、疗效不稳定，以及现有植物来源细胞外囊泡的制备工艺复杂、离心步骤多、耗时长、产率低、稳定性差等缺陷。

2、为了实现上述目的，本领域技术人员提出了一种地锦草来源细胞外囊泡分离提取方法，包括以下步骤：

3、步骤(1)：将新鲜地锦草根茎用普通自来水清洗干净，后用双蒸水冲洗，沥干表面水分；

4、地锦草根纤细，常不分枝；茎匍匐，自基部以上多分枝；叶对生，呈矩圆形或椭圆形；花序单生于叶腋，边缘具白色或淡红色附属物；蒴果呈三棱状卵球形，花柱宿存；种子呈三棱状卵球形，灰色，无种阜。

5、步骤(2)：将步骤(1)晾干水分的地锦草切碎，提前-20℃预冷30分钟，研磨后过滤，弃去滤渣，收集滤液，滤液中加入等体积的磷酸盐缓冲液；

6、步骤(3)：将步骤(2)所得滤液在4℃下3500xg离心10—15min；弃去沉淀，取上清液，在4℃下10000xg离心20—30min，收集上清液；

7、步骤(4)：将步骤(3)中收集的上清液通过40μm的细胞筛网进行过滤，去除微米级别大颗粒，得到精上清液；

8、步骤(5)：吸取15ml步骤(4)中所得上清液转移至vivaspi n 2超滤管(300kdamwco)中，在4℃下3500xg离心10—20min进行浓缩，得到粗地锦草细胞外囊泡浓缩液；

9、步骤(6)：将步骤(5)所述浓缩液置于固定角转子中，4℃下100000xg离心20—30min，随后弃去上清液，用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，随后过0.22μm的滤膜，得到悬液；

10、步骤(7)：将收集的悬液从顶部加入从下而上依次装有60wt％、45wt％、30wt％碘化乙二醇溶液的超速离心管中，再在碘化乙二醇溶液最上层加入步骤(5)中所得的沉淀悬液，然后在4℃下140000xg超速离心60—90min；

11、步骤(8)：将步骤(7)碘化乙二醇溶液中的细胞外囊泡条带吸出，溶液置入50ml离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液定容至50ml混合均匀，在4℃下150000g继续超速离心60—90min除去碘化乙二醇溶液；

12、步骤(9)：收集步骤(8)所得沉淀，加入1ml磷酸盐缓冲液重悬，用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，即得到地锦草细胞外囊泡滤液；

13、步骤(10)：获得的地锦草细胞外囊泡滤液中加入1/3体积2wt％的硫酸葡萄糖胺溶液作为细胞外囊泡的保护剂，随后进行真空冷冻干燥，即可得到以冻干形式保存的地锦草细胞外囊泡。

14、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，步骤(1)中地锦草使用普通自来水冲洗干净后，最后一步需要使用双蒸水冲洗。

15、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，步骤(2)中地锦草切碎长度为2—3cm且研磨前地锦草根茎需要提前-20℃预冷30分钟。

16、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，步骤(3)所述的离心具体为：在离心力3500xg，4℃离心10—15分钟，弃去沉淀，收集上清液，再在离心力10000xg，4℃离心20—30min，得到上清液。

17、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，所述步骤(4)的过滤具体为：将步骤(3)中收集的上清液通过40μm的细胞筛网进行过滤，去除大部分微米级别大颗粒，得到精上清液。

18、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，所述步骤(5)的超滤浓缩具体方法是：吸取15ml上述精上清液加入vivaspi n 2超滤管(300kda mwco)中，在4℃下3500xg离心10—20min进行浓缩，得到粗地锦草细胞外囊泡浓缩液。

19、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，步骤(6)的具体步骤为：在离心力100000xg，4℃离心20—30分钟，离心结束后重悬沉淀的磷酸盐缓冲液体积为5ml。

20、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，步骤(7)的具体步骤为：将步骤(6)所得重悬液装入离心管中，依次加入质量浓度60％、45％、30％梯度碘化乙二醇溶液，在离心力140000g，4℃离心60—90分钟，收集45～60％之间的细胞外囊泡条带。

21、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，所述步骤(8)的具体方法为：将步骤(7)所得细胞外囊泡条带用磷酸盐缓冲液混合，定容为50ml，在离心力150000g，4℃下离心60—90分钟。

22、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，所述步骤(9)的具体方法为：将步骤(8)所得沉淀用1ml磷酸盐缓冲溶液重悬，用0.22μm的滤膜过滤除菌，即得到地锦草来源细胞外囊泡。

23、进一步的，上述的分离提取地锦草来源细胞外囊泡的方法，所述步骤(10)的具体方法为：对步骤(9)获得的地锦草细胞外囊泡，加入1/3体积2wt％的硫酸葡萄糖胺溶液作为细胞外囊泡的保护剂，随后进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥条件具体为：温度：-60℃，真空度：5～10pa，时间：24h。

24、最后，对步骤(9)或(10)得到的地锦草细胞外囊泡进行鉴定，鉴定方式采用透射电镜检测、zeta电位检测和dls粒径分析鉴定检测。

25、一种地锦草来源细胞外囊泡，采用第一个技术方案的提取方法制得的。

26、该地锦草来源细胞外囊泡展现出良好的安全性及抗炎活性，250ug/ml的地锦草来源细胞外囊泡对raw264.7巨噬细胞的细胞存活率为60.71％，ic50为296.1ug/ml，相比较于常规传统药物，对细胞毒性较小。不同浓度梯度的地锦草细胞外囊泡可降低raw264.7巨噬细胞il-6和tnf-α炎性细胞因子分泌，具有良好的抗炎活性，可以作为制备抗炎药物的应用。

27、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

28、1、地锦草胞外囊泡的制备方法优化：本发明采用的提取和分离技术采用一步低速离心结合300kda超滤浓缩即可实现对地锦草细胞外囊泡的粗提取，使得细胞外囊泡在较少离心次数、较低转速和一步超高速离心操作下即可得沉淀，简化和优化了胞外囊泡的制备过程，适合工业大规模生产。

29、2、地锦草胞外囊泡制备工艺参数的优化：应用碘化乙二醇替换蔗糖溶液进行密度梯度离心，对提取到的地锦草细胞外囊泡进行分离纯化。相较于蔗糖，碘化乙二醇具有更为均匀的密度分布，可以更精确地分离不同密度的细胞外囊泡，提高了地锦草细胞外囊泡的纯化效率以提高胞外囊泡的产量和质量。

30、3、地锦草细胞外囊泡的制备成本的降低：本发明提供的技术方案先对地锦草根茎进行低温-20℃预冷，后直接进行组织研磨，研磨后往滤液中等体积添加磷酸盐缓冲液，进行囊泡溶解，相对于其他溶液，磷酸盐缓冲液价低易得且能使细胞外囊泡保持良好的生物活性，提高地锦草胞外囊泡的稳定性，并降低制备过程中的成本和复杂性。

31、4、地锦草细胞外囊泡的提取质量的提高：本发明使用硫酸葡萄糖胺溶液作为细胞外囊泡的保护剂，进行真空冷冻干燥，减缓冷冻过程中膜蛋白的结构变化，有助于维持囊泡的完整性，保留囊泡内部物质的生物活性。本发明提供的技术方案制备的细胞外囊泡形态规则完好，破损率低，透射电镜下形态为凹状类圆形，粒径分布平均值为202.9nm，聚集度指数po lyd i spers ity i ndex(pdi)为0.2503，颗粒尺寸分布均匀集中。zeta电位为-18.7，符合多项研究所表明植物来源细胞外囊泡电位为负值的特点，稳定性高。

32、5、本发明提供的技术方案所得到的地锦草细胞外囊泡展现出良好的生物安全性及抗炎活性，250ug/ml的地锦草来源细胞外囊泡对raw264.7巨噬细胞的细胞存活率为60.71％，i c50为296.1ug/ml，相比较于常规传统药物，对细胞毒性较小。不同浓度梯度的地锦草细胞外囊泡可降低巨噬细胞il-6和tnf-α炎性细胞因子分泌，具有良好的抗炎活性，可以作为制备抗炎药物的应用。

33、6、本发明提供的地锦草细胞外囊泡提取方法，操作流程简单，所提取的囊泡形态均一良好、粒径分布均匀集中、稳定性好、纯度高，具有良好的生物安全性及抗炎活性，具有良好的研究前景本发明提供的地锦草细胞外囊泡提取方法，操作流程简单，所提取的囊泡形态均一良好、粒径分布均匀集中、稳定性好、纯度高，具有良好的生物安全性及抗炎活性，具有良好的研究前景。