一种使用核糖核酸酵母RNA检测全能核酸酶活性的方法与流程

本发明属于核酸酶检测，具体涉及一种使用核糖核酸酵母rna检测全能核酸酶活性的方法。

背景技术：

1、全能核酸酶是一种非特异性核酸水解酶，具有高效的水解核苷酸活力，能降解大多数形式的核苷酸。无论是单链、双链、线性、环状、超螺旋等形式的dna还是rna分子，都能被全能核酸酶水解。由于全能核酸酶的作用底物的多样化，其在各个领域都有广泛的应用。例如，在生物制品中，全能核酸酶可以解决制备过程中宿主核酸残留难以去除的问题，提升生物制品的品质和功效；在蛋白纯化中可以降解细胞裂解液的粘度，缩短样品的处理时间，有效提高目的蛋白的产量，提高蛋白纯化的效率；在生化分析样品制备中，可以降低残留核酸带来的影响，提高生化分析过程中的分辨率和回收率；在医药方面，全能核酸酶可被用于控制促进毒性的转基因生物的释放，还可以作为肿瘤治疗药物的辅助试剂、用于治疗红斑性狼疮、儿童急性气喘等。

2、由于这些应用，全能核酸酶引起了与污染、产品和药品质量控制有关的问题。即全能核酸酶的存在可能会严重影响产品的质量或/和使科学实验的结果不可靠。因此，现有技术中开发了多种方法来定量检测样品中全能核酸酶的活性或浓度。例如，中国专利申请公开文本cn117230052a中公开了一种全能核酸酶活力检测的方法，配制1mm mgcl2、0.1mg/mlbsa(牛血清白蛋白)、50mm tris-hcl，ph 8.0缓冲液稀释的核酸酶样品，并配制鲑鱼精dna浓度50μg/ml，将2.5ml鲑鱼精dna溶液中加入稀释的核酸酶样品0.125ml，于37℃水浴反应30分钟，测定260nm的吸光度变化，扣除相应空白后计算酶活性。中国专利申请公开文本cn117384881a中公开了一种全能核酸酶的酶活测定方法，用ph为8.0的含有1mm mgcl2和0.1mg/ml bsa的tris-hcl缓冲液将鲑鱼精dna溶液稀释至1mg/ml，并用同样的缓冲液将待测酶样品稀释至10-4u/μl，将预冷的稀释后的鲑鱼精dna溶液和预冷的稀释后的待测酶样品溶液按比例混合均匀，置于37℃水浴加热30min，然后加入4％高氯酸溶液，混合均匀后冰浴30min；在4℃下以14000rpm的速度离心6min，取上清用紫外分光光度计检测260nm处的吸光度值，根据吸光度的变化值和酶活计算公式计算酶活。

3、这些方法中均是以鲑鱼精dna作为底物来检测全能核酸酶的酶活，dna作为底物的检测成本太高；且这些方法中均未公开待测样品的检测浓度范围，本领域技术人员不能确定这些方法是否适合所有情况下的全能核酸酶酶活的检测。而且在无待测样品检测浓度范围的情况下，未知酶活性的酶制剂被稀释不同倍数时，可以得出不同的酶活性，无法得到准确的酶活性。本发明专利基于以上这些情况，选取价格便宜的核糖核酸酵母作为底物试剂，对底物浓度进行优化，规定合适的待测样品酶浓度，提高了酶活性检测效率和准确度。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明提供一种使用核糖核酸酵母rna检测全能核酸酶活性的方法。该方法以核糖核酸酵母rna作为底物，与全能核酸酶进行酶促反应，根据水解产物在260nm处的最大吸收峰来定量计算酶活。该方法操作简单，无需通过酸沉淀或碱沉淀等复杂的方式提取rna，试剂成本低廉，检测过程安全，提供了合适的待测样品的浓度范围，检测效率高，准确度高，适用范围广。

2、具体地，本发明采用如下技术方案来实现上述目的：

3、一种使用核糖核酸酵母rna检测全能核酸酶活性的方法，包括以下步骤：

4、s1、用置于冰上预冷的酶稀释液将全能核酸酶稀释f倍，得到待测酶液；所述酶稀释液为含有mg2+和白蛋白的tris-hcl缓冲液；提取核糖核酸酵母的rna，配制成rna溶液，置于0～4℃预冷；

5、s2、将体积为v的所述待测酶液与所述rna溶液按体积比1:20混合均匀，得到总体积为v的待测样品溶液；将所述酶稀释液与所述rna溶液按体积比1:20混合均匀，得到空白对照溶液；同时将所述待测样品溶液和所述空白对照溶液置于恒温水浴锅中，开始计时；

6、s3、每隔一段时间取一定体积的水浴孵育后的所述待测样品溶液加入到等体积的冰上预冷的高氯酸溶液中，冰浴30min，然后于4℃下离心，取上清液，测量所述上清液在260nm处的od值；按照与所述待测样品溶液同样的处理方法测量所述空白对照溶液在260nm处的od值；

7、s4、用在不同取样时间点t时取样检测得到的所述待测样品溶液的od值减去对应时间点检测得到的所述空白对照溶液的od值，得到不同取样时间点t的吸光度差值δa；以时间点t为横坐标，吸光度差值δa为纵坐标，绘制标准曲线；标准曲线的斜率k为0.002～0.0045；根据如下公式计算全能核酸酶的酶活：

8、

9、其中，x为所述待测样品溶液中全能核酸酶的酶活力，单位为u/ml；

10、δa：以步骤s2中开始计时的时间为0计算，在取样时间点t时所述待测样品溶液在260nm处的吸光度与所述空白对照溶液在260nm处的吸光度的差值；

11、v：所述待测样品溶液的总体积，单位为ml；

12、v：步骤s2所述待测样品溶液中所述待测酶液的体积，单位为ml；v/v＝21:1；

13、t：步骤s3中每次取样时所述待测样品溶液在恒温水浴锅中的孵育时间，单位为min；

14、2：步骤s3中一定体积的水浴孵育后的所述待测样品溶液的稀释系数；

15、30：30min定义一个酶活单位。

16、在优选的方案中，所述tris-hcl缓冲液的ph为7.0～10.0，浓度为0.01～0.1mol/l。

17、在进一步优选的方案中，所述tris-hcl缓冲液的ph为7.0～9.0，浓度为0.05mol/l。

18、在再进一步优选的方案中，所述tris-hcl缓冲液的ph为7.0～8.5，浓度为0.05mol/l。

19、在更进一步优选的方案中，所述tris-hcl缓冲液的ph为7.5，浓度为0.05mol/l。

20、在优选的方案中，所述酶稀释液中mg2+的浓度为0.2mg/l，所述酶稀释液中白蛋白的浓度为0.1mg/l。

21、在优选的方案中，步骤s1中提取核糖核酸酵母的rna的方法包括以下步骤：将核糖核酸酵母加入到溶剂中，煮沸19～21min，调节ph为7.0～10.0，用对应ph值的所述酶稀释液定容，配制成核糖核酸酵母浓度为0.08mg/ml的溶液，离心，收集上清液，即得到所述rna溶液。

22、在进一步优选的方案中，所述溶剂为无菌水或/和tris-hcl缓冲液。

23、在进一步优选的方案中，调节ph所使用的试剂为氨水。氨水浓度优选0.2％。

24、在进一步优选的方案中，调节ph为7.0～9.0。

25、在再进一步优选的方案中，调节ph为7.0～8.5。

26、在更进一步优选的方案中，调节ph为7.5。

27、在优选的方案中，步骤s2中所述恒温水浴锅的水温为20～40℃。

28、在进一步优选的方案中，步骤s2中所述恒温水浴锅的水温为25～40℃。

29、在再进一步优选的方案中，步骤s2中所述恒温水浴锅的水温为30～40℃。

30、在优选的方案中，步骤s3中所述高氯酸溶液的浓度为4％。

31、本发明的技术方案具有以下有益效果：本发明中使用核糖核酸酵母rna作为底物检测全能核酸酶酶活性的方法操作简单，底物提取简单，成本低廉，反应条件温和，检测过程安全，适用于饲料添加、生物制品、蛋白纯化、生物分析、医药领域等领域的全能核酸酶酶活性的检测。对于酶活性未知的样品，根据本发明中的方法，经过多次预实验得出酶活性的大概范围后，控制标准曲线的斜率为0.002～0.0045，同时酶浓度控制在2.5～5.7u/ml，全能核酸酶酶活性检测结果的相对标准偏差显著低于8％(酶活性检测规定的标准偏差范围上限为10％)。当酶浓度不在该范围之内，稀释倍数不同，酶活检测结果的相对标准偏差均大于8％。可见本技术操作简单，提高了酶活性检测效率和准确度。