同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条及其制备方法

本发明属于免疫检测，特别涉及一种同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条。

背景技术：

1、甲胎蛋白是一种由591个氨基酸组成的糖蛋白。当成年人肝细胞受损时，肝脏干细胞可分化为肝细胞和胆管细胞，而干细胞的自子代有合成afp的功能，也有发展成肿瘤细胞的风险，因此，afp作为一种特异的血液标志物广泛应用于原发性肝癌的普查和诊断中。在正常成年人血液中afp含量极低，一般小于20ng/ml，甚至很更低，但当人体内肝细胞发生病变时，血液中afp的含量就会明显升高，当血液afp含量大于400ng/ml时，就有患有原发性肝癌的风险。

2、甘胆酸是肝脏以胆固醇为原料合成的，是由胆酸和甘氨酸结合而成的结合型胆酸，是胆酸汁的重要成分之一，肝脏是机体合成甘胆酸的唯一器官。正常成年人血液中gca含量甚微0.4-2.98μg/ml，但是当肝细胞损伤时，血液中甘胆酸的浓度随即升高，所以肝胆疾病患者甘胆酸水平升高的阳性率很高。

3、肝癌的诊断手段主要为影像学诊断和血清学检查，血清学检查主要是检测肿瘤标志物，而甲胎蛋白是目前最常见的肿瘤标志物之一，但是其在肝癌筛查的敏感度不高，单独检测这一种肿瘤标志物容易造成诊断的假阳性，而甘胆酸作为一种肝脏疾病标志物，其和肝癌之间有着较高的特异性，因此甲胎蛋白与甘胆酸的联合检测有利于提高肝癌诊断的灵敏度和特异性。

4、现有专利cn108192875b公开了一种杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的甘胆酸单克隆抗体和检测试剂盒，其杂交瘤细胞株产生的甘胆酸单克隆抗体的效价较高，其具有灵敏度高，特异性强等特点。专利cn105481977a公开了一种基于抗甘胆酸特异性抗体的甘胆酸的免疫检测试剂及其制备方法，其制备了时间分辨免疫层析试纸，提高了甘胆酸临床检测的准确性，但是上述方案需要借助时间分辨荧光免疫层析仪器才可以分析，无法通过肉眼直接判断。专利cn108896756b公开了一种胶体金-聚苯胺-金纳米复合微球及其制备方法和应用，其用胶体金纳米-聚苯胺-金纳米复合微球代替常规的胶体金结合甘胆酸单抗制备了免疫层析试纸条，可以快速检测样本中甘胆酸的含量，但其只能检测甘胆酸的含量，针对肝脏普通疾病进行判定，不能对肝癌进行进一步确定。

5、目前，用于免疫层析试纸条标记的材料主要为胶体金纳米粒子，胶体金本身为红色，其标记物相对稳定，因而被广泛地应用于免疫层析试纸条中，且尚未有一种胶体金检测试剂盒同时且通过快速检测血液中的甲胎蛋白与甘胆酸来作肝癌初筛。因此本专利开发了一种同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条，为在血液中甲胎蛋白和甘胆酸的同时检测、肝癌初筛提供一种快速、准确、可靠的检测试纸。

2、一种同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、nc膜、吸水垫和pvc板，nc膜位于pvc板的中部，结合垫位于nc膜的下部的一侧并与之部分重叠，样品垫位于结合垫下部与nc膜相反的一侧与结合垫部分重叠，吸水垫位于nc膜的上部与结合垫相反一侧并与之部分重叠，nc膜靠近样品垫一端为起始端，靠近吸水垫一端为末端，所述的nc膜上靠近起始端的依次包被有甘胆酸包被抗原作为检测线2，包被有甲胎蛋白单克隆抗体ii为检测线1，靠近末端的包被的为羊抗鼠igg抗体为质控c线；所述的结合垫上喷涂有胶体金-抗体的复合物。

3、进一步的，上述的同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条，所述的胶体金-抗体的复合物为胶体金-甘胆酸单克隆抗体与胶体金-甲胎蛋白单克隆抗体i的混合物。

4、进一步的，上述的同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条，所述的胶体金-抗体的复合物为胶体金-甘胆酸单克隆抗体与胶体金-甲胎蛋白单克隆抗体i的体积比为1∶1。

5、进一步的，上述的同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条，所述的胶体金-甘胆酸单克隆抗体通过下述方法制备的：取1ml胶体金溶液，加入0-8μl 0.2m k2co3调整溶液的酸碱度ph值6-8，随后加入2-10μl甘胆酸单克隆抗体，室温下反应一个小时，然后加入100μl 100mg/ml牛血清白蛋白溶液用于封闭未结合位点；反应一个小时后，离心取沉淀，用20μl pbs复溶，得胶体金-甘胆酸单克隆抗体。

6、进一步的，上述的同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条，所述的胶体金-甲胎蛋白单克隆抗体i通过下述方法制备的：取1ml胶体金溶液，加入0-8μl 0.2m k2co3调整溶液的酸碱度ph值6-8，随后加入2-10μl甲胎蛋白单克隆抗体i，室温下反应一个小时，然后加入100μl 100mg/ml牛血清白蛋白溶液用于封闭未结合位点。反应一个小时后，离心取沉淀，用20μl pbs复溶，得胶体金-甲胎蛋白单克隆抗体i。

7、进一步的，上述的同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条，所述的甘胆酸包被抗原通过下述方法制备的：将51mg固体甘胆酸完全溶解于1.5ml二甲基甲酰胺溶液中；向其中分别加入29.1mg n，n-二环己基碳二亚胺和17.25mg n-羟基琥珀酰亚胺，室温下避光搅拌过夜；在4℃，1000rpm的条件下离心10分钟，分离得到其上清液后，进行超滤浓缩得到包被抗原。

8、进一步的，上述的同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条，所述的甘胆酸单克隆抗体是通过培养cg-706，保藏编号为cgmcc no.15292的甘胆酸杂交瘤细胞株，致敏小鼠腹腔制备腹水，并用辛酸-硫酸铵法纯化即得甘胆酸单克隆抗体。

9、进一步的，上述的同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条，所述的甲胎蛋白单克隆抗体i与甲胎蛋白单克隆抗体ii采购于上海领潮生物新材料有限公司。

10、本发明提供的第二个技术方案是的同时检测甲胎蛋白与甘胆酸的免疫层析试纸条的制备方法，依次包括下述步骤：

11、1)在nc膜上以1μl/cm的速度划取1-2mg/ml的甘胆酸包被抗原，0.4-0.8mg/ml的甲胎蛋白单克隆抗体ii以及0.5-1.0mg/ml的羊抗鼠igg抗体；

12、2)在结合垫上以7.5μl/cm的载样量喷涂的胶体金-抗体的复合物；

13、3)将步骤1)制备的nc膜贴在底板上，在底板上方靠近质控线的一端贴上吸水垫，在底板下方贴上步骤2)制备的结合垫与样品垫；其中，质控线和检测线的间距为5mm，结合垫与样品垫之间，垫与nc膜之间以1mm的距离相互叠着；拼装完成后37℃干燥。甲胎蛋白单克隆抗体1和甲胎蛋白单克隆抗体2的是一对配对的单克隆抗体，分别针对了甲胎蛋白的不同的抗原决定簇，可以同时与甲胎蛋白结合，进行双抗夹心，其中，甲胎蛋白单克隆抗体1、甲胎蛋白单克隆抗体2为一对配对的单克隆抗体，他们两个分别针对了甲胎蛋白的不同的抗原决定簇，可以同时与甲胎蛋白结合，具体地：甲胎蛋白单克隆抗体1的货号是l1c00302；甲胎蛋白单克隆抗体2的货号是l1c00301；进行双抗夹心均采购于：上海领潮生物新材料有限公司。

14、本发明上述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：

15、本发明可同时检测血液中甘胆酸和甲胎蛋白含量，制备了胶体金-甲胎蛋白单克隆抗体i和胶体金-甘胆酸单克隆抗体，将其同时组装在了同一个试纸条上，检测线2(t2线)为甘胆酸包被抗原，检测线1(t1线)为甲胎蛋白单克隆抗体ii，c线为质控线，是羊抗鼠igg抗体。甘胆酸检测使用的为竞争法，甲胎蛋白检测使用的为双抗夹心法。当甲胎蛋白与甘胆酸都为阴性时，胶体金-抗体的复合物只与t2线和c线结合，出现两条线；当甲胎蛋白为阴性，甘胆酸为阳性时，胶体金-抗体的复合物只与c线结合，出现一条线；当甲胎蛋白为阳性，甘胆酸为阴性时，胶体金-抗体的复合物与t1，t2，c线都结合，出现三条线；当甲胎蛋白和甘胆酸都为阳性时，胶体金-抗体的复合物只于t1线和c线结合，出现两条线。从而实现在同一个试纸条上面同时对甲胎蛋白与甘胆酸进行定性和半定量分析。其检测过程方便简洁，检测时间较短，且检测成本低，可以用于肝癌快速初筛，具有极大的应用价值，市场前景广阔。