新型裂解多糖单加氧酶及其应用

本发明涉及生物，特别涉及一种来源于海洋真菌的新型裂解多糖单加氧酶。

背景技术：

1、木质纤维素是目前地球上最丰富的有机聚合物，其不溶于水且对常规水解作用具有高度抗性，被认为难以进行深度转化。然而，其在生物技术应用方面具有巨大潜力，因为大量的研究证明其可用于生产可持续生物能源和一些重要的化工原料。木质纤维素生物质的前处理作为工业产业链中的必要环节，其中节能减排和环境保护是重中之重。酶法处理木质纤维素生物质是实现高效节能的典型工艺。其中，裂解多糖单加氧酶（lyticpolysaccharide monooxygenases，lpmos）是一类新发现的可参与木质纤维素转化的酶种。lpmos可通过某些氧化机制破坏生物质中的糖苷键，使其结构松散，为常规糖苷水解酶提供更多的结合位点，从而辅助强化水解作用。cazy数据库已根据lpmos的序列特征将其分类为八个辅助活性（aa）家族。其中，aa9、aa11、aa13、aa14、aa16和aa17都源自真菌，而aa9是最大的真菌lpmos家族。

2、lpmos介导的反应是通过使用外部电子供体（还原剂）将活性位点上的铜离子从cu（ii）还原成cu（i）开始的。值得注意的是，这些还原剂会在不同程度上影响lpmos的反应，如使用不适合的还原剂或添加不正确浓度的电子供体会显著影响酶的活性。尽管一些研究表明，某些lpmos在富含木质素的木质纤维素材料上的作用不需要额外的外部还原剂。但由于木质纤维素是复杂的多聚物，与酶的相互作用机制极其复杂，至今仍不明确其作用过程，因此并不能证明在lpmos转化含木质素的材料中没有可作为电子供体的化合物参与。不过，据人们所知，迄今为止，对于常规多聚底物（如不溶性纤维素、半纤维素等），几乎所有的lpmos都需要额外的还原剂才能启动反应。

3、现有技术记载了一种粘细菌分泌的裂解多糖单加氧酶与传统纤维素酶、几丁质酶的协同处理纤维素，能够不同程度的提高还原糖产量（118%~188%）。缺陷在于，在应用该酶时，需要与其他酶共同作用才能完成物质转化，尽管提升了转化效率，但在一定程度上也增加了额外的成本。

4、现有技术还记载了一种裂解多糖单加氧酶及其在纺织冷堆工艺中的应用，通过与多种酶复配得到一种生物酶复配制剂，利用裂解多糖单加氧酶作用于淀粉的c1或c4糖苷键，显著强化了退浆效果。但是同样地，该酶需要在酶制剂复配中方能产生协同效果，也增加了额外的成本。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种来源于海洋真菌的新型裂解多糖单加氧酶，具有宽泛的温度和ph作用范围，无需还原剂即可发生反应，在纤维素降解中具有巨大的应用价值。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了裂解多糖单加氧酶，其来源于保藏编号为gdmcc no: 62047的菌株。

4、在本发明的一些具体实施方案中，上述裂解多糖单加氧酶的制备方法包括：基于保藏编号为gdmcc no: 62047的菌株的基因组获得所述裂解多糖单加氧酶的编码基因，表达所述编码基因，获得所述裂解多糖单加氧酶。

5、在本发明的一些具体实施方案中，上述裂解多糖单加氧酶具有：

6、（a1）、如seq id no: 1所示的氨基酸序列；或

7、（a2）、如（a1）所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与（a1）的相同或相似；或

8、（a3）、与如（a1）或（a2）所示的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列。

9、本发明提供了上述裂解多糖单加氧酶在如下任一项中的应用：

10、（b1）、降解或辅助降解纤维素、半纤维素、人工纤维素底物、多糖和/或低聚糖；

11、（b2）、制备降解或辅助降解纤维素、半纤维素、人工纤维素底物、多糖和/或低聚糖的产品。

12、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述的纤维素包括棉纤维、麻纤维、木纤维、竹纤维或秸秆纤维中的一种或多种。

13、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述的半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖或阿拉伯聚糖中的一种或多种。

14、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述的人工纤维素底物包括羧甲基纤维素、羟乙基纤维素或微晶纤维素中的一种或多种。

15、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述的多糖包括淀粉、糖原、纤维素、几丁质、透明质酸、肝素、硫酸软骨素、琼脂糖、葡聚糖、菊糖、香菇多糖、灵芝多糖或地衣多糖中的一种或多种。

16、在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述的低聚糖包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、壳寡糖或β-葡聚糖中的一种或多种。

17、本发明提供了核酸分子，其具有编码上述裂解多糖单加氧酶的基因；

18、所述基因的序列为：

19、（c1）、如seq id no: 2所示的核苷酸序列；或

20、（c2）、如（c1）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或若干个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（c1）的相同或相似；或

21、（c3）、与如（c1）或（c2）所示的核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列。

22、本发明提供了表达载体，其具有上述核酸分子。

23、本发明提供了上述裂解多糖单加氧酶、上述核酸分子或上述表达载体在制备用于降解或辅助降解木质纤维素的产品中的应用。

24、本发明提供了用于降解或辅助降解木质纤维素的产品，包括上述裂解多糖单加氧酶。

25、在本发明的一些具体实施方案中，上述产品还包括糖苷水解酶。

26、在本发明的一些具体实施方案中，上述产品所述的糖苷水解酶包括纤维素酶。

27、在本发明的一些具体实施方案中，上述产品所述的糖苷水解酶包括木糖苷酶、岩藻糖苷酶、几丁质酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-阿拉伯糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶中的一种或多种。

28、本发明提供了降解或辅助降解木质纤维素的方法，包括基于上述裂解多糖单加氧酶实现降解或辅助降解木质纤维素。

29、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括：将可接受的辅料或助剂、糖苷水解酶、上述裂解多糖单加氧酶与待降解物混合，反应，实现降解或辅助降解木质纤维素。

30、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括：表达上述核酸分子，获得酶，将所述酶、可接受的辅料或助剂、糖苷水解酶与待降解物混合，反应，实现降解或辅助降解木质纤维素。

31、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括：表达上述表达载体，获得酶，将所述酶、可接受的辅料或助剂、糖苷水解酶与待降解物混合，反应，实现降解或辅助降解木质纤维素。

32、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括：将上述产品与待降解物混合，反应，实现降解或辅助降解木质纤维素。

33、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述的糖苷水解酶包括纤维素酶。

34、在本发明的一些具体实施方案中，上述方法所述的糖苷水解酶包括木糖苷酶、岩藻糖苷酶、几丁质酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-阿拉伯糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶中的一种或多种。

35、本发明的新型裂解多糖单加氧酶malpmo9k相对于现有公开数据库中的酶在序列上相似性非常低，表明本发明的酶有可能是新发现的酶种。

36、malpmo9k在ph 4~8条件下均可以保持40%以上的酶活性，直到ph 10的条件下，仍保留20%的活性，表现出了极强的ph耐受性。此外，malpmo9k在10~40℃下均可以保持30%以上的酶活性，即使温度升高至70℃，也未完全失活，表明malpmo9k具有宽泛的温度和ph作用范围。

37、malpmo9k在抗坏血酸浓度为2 mm时的酶活力最大，在抗坏血酸浓度为0 mm的条件下仍能执行80%以上的活性，意味着，在实际应用中，malpmo9k可以不需要额外补充还原剂即可执行裂解多糖单加氧酶的功能。