一种检测肺癌T淋巴细胞亚群的试剂盒及方法与流程

本发明属于医学检测，具体涉及一种检测肺癌t淋巴细胞亚群的试剂盒及方法。

背景技术：

1、免疫系统由免疫器官、免疫细胞及免疫活性物质组成，具有免疫防御、免疫监视、免疫稳定的功能。其中细胞免疫在机体抗肿瘤中具有重要作用，其中淋巴细胞是细胞免疫的重要部分。淋巴细胞亚群依据其生物功能及细胞表面抗原可分为：t淋巴细胞、b淋巴细胞和自然杀伤细胞(nk细胞)，其中t淋巴细胞是最主要的免疫表达形式，发挥着重要的免疫监视作用。t淋巴细胞按功能不同可分为辅助性t细胞(helper t cells,th)、细胞毒性t细胞(cytotoxic t cells,tc)、调节性t细胞(regulatory cells，treg)、效应性t细胞(effector t cells,te)。辅助性t细胞表面表达cd4分子，又称为cd4+t细胞，分泌细胞因子正向调节抗肿瘤作用，同时可调节b细胞分泌抗体，协助细胞免疫和体液免疫；细胞毒性t细胞表面表达cd8分子，又称为cd8+t细胞，通过分泌细胞毒性颗粒等对肿瘤细胞产生杀伤作用。cd3+t淋巴细胞、cd4+t淋巴细胞、cd8+t淋巴细胞数量及其比值之间保持动态平衡是保证机体细胞免疫功能正常的重要条件，如果其数量或比值出现明显变化提示机体免疫功能失衡，表明机体患病状态。

2、肺癌是最常见的肺原发性肿瘤。近半个世纪以来，肺癌的发病率和死亡率迅速上升，成为全球发病率最高的肿瘤之一。肺癌起病隐匿，在病程早期缺乏典型临床表现，一般为咳嗽、咳痰、发热等常见的呼吸道疾病症状，这也导致早期发现困难，以致错失手术根治的机会。目前肺癌的治疗方式主要有：外科手术切除、放射性治疗、药物治疗(包括化疗、靶向治疗和免疫治疗)等，对于肺癌中晚期患者往往采用综合治疗或全身治疗的方式以达到根治或者相对长的无症状生存期，其中化疗是非常重要的治疗方式。早期明确诊断或预测晚期肺癌预后情况有助于改善预后及帮助临床即时调整用药方案，使患者获益最大化。

3、然而，化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会对人体免疫系统产生一定的影响，若免疫系统出现失衡、免疫监视低下，肿瘤侵袭性可能会增强；而体现人体发挥免疫功能的是外周血的淋巴细胞及nk细胞，这些细胞数量及比值反映了机体的免疫状态。据研究表明，化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，存在一定的细胞毒性，可能导致骨髓抑制、感染、贫血等不良反应，细胞数量会有一定的变化。

4、2021年hou等人研究t淋巴细胞在血液肿瘤(弥漫性大b细胞淋巴瘤)中的作用，该研究表明弥漫性大b细胞淋巴瘤患者治疗前t淋巴细胞亚群细胞计数较健康对照组的降低。由于化疗药物的毒性作用(环磷酰胺等)，使cd3、cd4、cd8细胞计数逐渐下降，治疗6周期后t细胞的数量恢复，化疗2个周期后t细胞的功能恢复；研究结果反映了机体免疫功能的恢复与合理治疗相关。免疫疗法的目标是通过cd4+和cd8+t细胞的效应细胞以及记忆细胞对特定癌症抗原反应来触发抗肿瘤免疫反应，监测免疫细胞数量及比值的变化有助于监视及调节抗肿瘤反应。有研究表明，恶性肿瘤的预后与免疫系统的组成和功能密切相关，该研究提示外周cd4+t淋巴细胞数量与肺癌总生存期相关，cd8+t淋巴细胞与总生存期无关。高水平cd3细胞数量的患者拥有更长的总生存期(p＜0.05)，高水平的cd4细胞数量和cd4/cd8比值的患者有更长的生存期，高水平cd8细胞数量的患者有较短的无病生存期。化疗是癌症肿瘤的重要治疗方式，然而化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会影响机体的免疫状态，特别是t细胞介导的细胞免疫在机体抗肿瘤免疫反应机制中起着关键性作用。因此，在肺癌化疗过程中定期检测t淋巴细胞亚群的细胞数量对评估肿瘤疗效、调整用药有重要的价值。

5、目前，流式细胞术是临床t淋巴细胞计数的“金标准”，但是其在临床应用中还存在着一些问题，比如依赖体积大、昂贵的仪器设备，需要专业的技术人员，检测试剂成本高等，不利于一些医疗资源有限地区的t淋巴细胞计数项目开展。显微镜计数成本经济，设备简单，但是操作复杂，准确度不高。而酶联免疫吸附试验需要反复洗涤耗时长，不便于操作。因此，针对一些医疗资源相对缺乏的地区或一些特殊临床应用场景需要开发一种简便、经济、适用性广的t淋巴细胞数量检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种能够即时且快速定量检测肺癌t淋巴细胞亚群中cd3、cd4、cd8细胞数量变化的试剂盒。

2、实现上述目的包括如下技术方案。

3、本发明第一方面提供一种检测肺癌t淋巴细胞亚群的试剂盒，所述试剂盒包括：垂直流免疫层析盒和三种信号探针；

4、所述垂直流免疫层析盒包括盒体，以及由下至上依次层叠设置于盒体上的吸水垫、滤膜和检测盖，所述检测盖上设有加样孔；

5、三种信号探针包括分别与三种抗体偶联的三种红色乳胶微球，其中，三种所述抗体分别为cd3抗体、cd4抗体和cd8抗体，所述抗体在所述红色乳胶微球中的标记量为11μg/25μl～14μg/25μl。

6、在一些实施例中，所述cd3抗体、所述cd4抗体和cd8抗体的单克隆号分别为sk7、sk3和hit8a。

7、在一些实施例中，所述信号探针制备时，所述抗体在所述红色乳胶微球中的标记量为12μg～13μg/25μl；优选地，所述信号探针制备时，所述抗体在所述红色乳胶微球中的标记量为12.4μg～12.6μg/25μl。

8、在一些实施例中，所述信号探针制备时，所述抗体与所述红色乳胶微球的偶联反应在pbs标记缓冲液中进行，其中，所述cd3抗体对应的所述pbs标记缓冲液的ph值均为7.3～7.7，所述cd4抗体对应的所述pbs标记缓冲液的ph值均为7～7.5，所述cd8抗体对应的所述pbs标记缓冲液的ph值为6.3～6.7。

9、在一些实施例中，所述信号探针的制备方法包括如下步骤：

10、向红色乳胶微球中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺进行活化反应得到活化后的红色乳胶微球，向所述活化后的红色乳胶微球加入pbs标记缓冲液得到活化微球悬液；

11、在所得活化微球悬液中加入所述抗体进行孵育；

12、向孵育完成后的溶液中加入封闭液进行封闭反应得到沉淀；

13、将所得沉淀加入标记复溶液混合均匀，即得所述信号探针。

14、在一些实施例中，所述标记复溶液含有7～9％蔗糖、1～2％海藻糖、1～2％酪蛋白钠、0.3～0.7％bsa、0.1m～0.2m ph8.5 gly-naoh、0.3～0.7％proclin300和3.8％～4.2％w/vpvp-k30。

15、在一些实施例中，所述滤膜为硝酸纤维素膜，且所述滤膜的孔径为4μm～6μm；和/或，

16、所述红色乳胶微球为聚苯乙烯红色微球；和/或，

17、所述吸水垫设置有两层。

18、本发明第二方面提供一种检测样品中t淋巴细胞亚群数量的试剂；优选为如所述的检测t淋巴细胞亚群的试剂盒在制备检测肺癌产品中的应用。其中，该产品可以是试剂、试剂盒等。

19、本发明第三方面提供一种检测肺癌t淋巴细胞亚群的方法，采用如上所述的检测t淋巴细胞亚群的试剂盒，所述方法包括如下步骤：

20、将采集的外周血样本采用密度梯度离心法处理得到单个核细胞沉淀，向所述单个核细胞沉淀中加入缓冲液得到单个核细胞液；

21、分别在所述单个核细胞液中加入三种所述信号探针进行孵育，孵育后分别加入到所述垂直流免疫层析盒的加样孔中进行层析处理，处理完成后进行比色分析。

22、在一些实施例中，所述密度梯度离心法包括如下步骤：

23、将采集的外周血样本加入淋巴细胞分离液进行离心处理，离心力为1200×g～1300×g，离心20min～25min，得到分层溶液；

24、吸取分层溶液中的白膜层进行第二次离心处理得到沉淀，离心力为500×g～600×g，离心8min～12min，所得沉淀为所述单个核细胞。

25、在一些实施例中，包含有所述cd3抗体的信号探针与所述单个核细胞液的用量比为2.3μl～2.7μl：50μl，所述单个核细胞液中的cd3细胞浓度为1000～1500cells/μl；包含有所述cd4抗体的信号探针与所述单个核细胞液的用量比为2.3μl～2.7μl：50μl，所述单个核细胞液中的cd4细胞浓度为1000～1500cells/μl；包含有所述cd8抗体的信号探针与所述单个核细胞液的用量比为2.6μl～2.8μl：50μl，所述单个核细胞液中的cd8细胞浓度为500～800cells/μl；和/或，

26、所述孵育的时间为9min～11min。

27、本发明中，发明人发现在肺癌治疗过程中cd3、cd4、cd8细胞数量变化在肺癌预后评估中具有价值，并通过分别利用cd3抗体、cd4抗体、cd8抗体修饰的红色乳胶微球对外周血经梯度密度分离的单个核细胞进行特异性标记，优化合适的抗体和抗体标记量，并通过设计的垂直流免疫层析盒实现特定的cd3细胞、cd4细胞、cd8细胞的分离与检测，从而构建一种特定t淋巴细胞亚群细胞数量的检测方法，能够实现cd3细胞、cd4细胞、cd8细胞定量检测，能够得到准确的t淋巴细胞亚群数量计数分析，使t淋巴细胞亚群数量监测低成本、普适化，实现对肺癌患者健康状态的评估，在肺癌治疗过程特别是化疗中，结合患者自身状况及检测到的t淋巴细胞亚群细胞数量的变化可预测患者疗效，能够及时有效地调整治疗方案。