一种pH响应型药酶联用的纳米平台及其制备方法与应用

本发明属于生物医药，涉及一种ph响应型药酶联用的纳米平台及其制备方法与应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,pa)为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一，其具有天然耐药性和易产生强耐药的生物被膜特点，成为全球公共健康的严峻威胁。

3、褐藻胶裂解酶因为其对黏液型pa生物被膜中的海藻酸钠成分具有降解作用，该酶在生物被膜病原体的杀菌应用中具有巨大的潜力，可用于pa等致病菌引起的耐药性，褐藻胶裂解酶与抗菌药物进行药酶联用，以达到根除pa的目的。但是，发明人研究发现，游离酶具有一定局限性，比如易变性和失活、很难回收利用、应用成本高等，导致褐藻胶裂解酶的实用性能较弱。

4、金属有机框架材料(mofs)具有优秀的结构延展性和多样性、极高的比表面积和高结晶度等特点，其中，zif-8因为其良好的生物安全性和简单快速的合成条件，可以用于载酶载药。然而，发明人研究发现，并非所有酶均可采用mofs进行负载。另外，发明人经过研究还发现，虽然包括zif-8纳米粒在内的抗菌活性有很多研究报道，但是其大多数都是关于体外杀菌效果的基础评估，很少在感染动物模型中进行杀菌有效性研究，其原因有：药物在体内需要进行复杂的代谢过程，其活性成分不一定能达到病灶处，从而无法实现体内杀菌的目的。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种ph响应型药酶联用的纳米平台及其制备方法与应用，本发明提供的纳米平台不仅在体外具有良好的杀菌作用，而且在体内也同样具有良好的抗感染效果。

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、第一方面，一种褐藻胶裂解酶g258q，简称为g258q，其基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。

4、本发明经过在前研究提供了褐藻胶裂解酶ralyi1，并在此基础上经过突变发现，g258q酶活高于ralyi1，温度稳定性明显提高，更有利于采用mofs进行负载。

5、第二方面，一种ph响应型药酶联用的纳米平台，由上述褐藻胶裂解酶g258q和左氧氟沙星共同封装于金属有机框架纳米粒zif-8形成。

6、本发明将褐藻胶裂解酶g258q和左氧氟沙星一起装载到zif-8中形成纳米平台gzl，由于zif-8的酸解效果，gzl具有ph响应性，而细菌在生物被膜形成过程中，代谢产生有机酸，导致其微环境呈弱酸性，因此该gzl能够靶向生物被膜，通过纳米粒本身的穿透性，以及释放的褐藻胶裂解酶能够破坏生物被膜，促进抗生素进一步发挥效果，达到深度杀菌的作用。

7、另外，研究表明，该gzl不仅具有体外抗菌效果，而且具有体内抗感染效果。

8、第三方面，一种上述ph响应型药酶联用的纳米平台的制备方法，包括如下步骤：

9、将左氧氟沙星与锌盐加入水中混合均匀获得溶液a；

10、将含有所述褐藻胶裂解酶g258q的酶液与二甲基咪唑溶液混合均匀获得溶液b；

11、将溶液a与溶液b进行混合，使锌离子与二甲基咪唑反应生成zif-8。

12、该制备方法在制备zif-8过程中，将g258q和左氧氟沙星封装至zif-8内，从而提高zif-8对g258q和左氧氟沙星的封装效果。

13、本发明所述的锌盐是指阳离子为锌离子的化合物，例如硝酸锌、氯化锌、硫酸锌等。溶液a中锌离子的浓度可以为10～100mm，例如10mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm，本发明浓度单位mm是指mmol/l，单位m是指mol/l。在一些实施例中，溶液a中锌离子的浓度为20～50mm。研究表明，该条件下，酶活和酶稳定性更好。优选为20～45mm，进一步优选为35～45mm。

14、本发明二甲基咪唑溶液中二甲基咪唑的浓度可以为0.1～2m，例如0.100m、0.125m、0.200m、0.250m、0.300m、0.400m、0.500m、0.600m、0.700m、0.800m、0.900m、1.000m、1.100m、1.200m、1.300m、1.400m、1.500m、1.600m、1.700m、1.800m、1.900m、2.000m，在一些实施例中，二甲基咪唑的浓度为0.1～1m。研究表明，该条件下，酶活和酶稳定性更好。

15、锌离子与二甲基咪唑的摩尔比1:1～20，可以为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17等。在一些实施例中，锌离子与二甲基咪唑的摩尔比1:4～16。

16、在一些实施例中，酶液中g258q酶的浓度为3～3.5mg/ml。

17、锌离子、g258q酶与二甲基咪唑的比例可以为40～200mmol:3～3.5g:160～800mmol。在一些实施例中，锌离子、g258q酶与二甲基咪唑的比例为150～170mmol:3～3.5g:630～650mmol。研究表明，该条件下能够在合成的gzl在孵育过程中能够维持更好地酶活。

18、反应时间为0.5～24h。研究表明反应时间对酶活性的影响不大，在一些实施例中，反应时间为8～24h。该调下对g258q酶和le的包封率更高。

19、第四方面，一种上述ph响应型药酶联用的纳米平台在抗菌或制备抗菌药物中的应用。

20、在一些实施例中，所述抗菌为抗铜绿假单胞菌。

21、本发明的有益效果为：

22、1.本发明提供的褐藻胶裂解酶g258q，与褐藻胶裂解酶ralyi1相比，具有更高的酶活性、温度稳定性以及对底物的亲和力，同时其能够清除铜绿生物被膜，并抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。

23、2.本发明提供ph响应型药酶联用的纳米平台，具有良好的ph响应性、酶学特性以及储存稳定性。经过实验表明，在同等左氧氟沙星浓度条件下，gzl具有更加优良的抑菌效果，并且gzl对成熟pa生物被膜的清除效果和对生物被膜形成的抑制效果都明显优于单独抗生素的效果，说明褐藻胶裂解酶使gzl在低浓度抗生素下反而具有更优异的杀菌效果，显示出显著协同作用，在pa的治疗应用方面有很大潜力。同时，通过体外溶血实验、细胞毒性实验和斑马鱼胚胎毒性实验表明，gzl生物安全性良好，表明其在生物医药领域有广泛的应用潜力。

24、3.本发明提供的ph响应型药酶联用的纳米平台会使细菌完整性破坏，导致胞内蛋白外流、胞外核酸含量的明显增加、膜电位发生明显变化，是因为zif-8能够释放锌离子，带有正电荷的锌离子能够与细菌表面的负表面电位相互作用，引起细菌细胞破裂；gzl处理后的pa菌体出现不同程度的破损，pa出现皱缩、凹陷等现象，细胞膜破损情况严重。另外，gzl能够诱导ros的大量产生，导致细菌死亡，且呈现纳米粒浓度依赖性。通过构建pa斑马鱼感染动物模型，探究gzl体内杀菌效果的实验结果表明，高浓度gzl组的斑马鱼100％存活，且伤口愈合良好；相比之下，空白组在24h之内全部死亡，高浓度抗生素组72h后40％存活，且存活的斑马鱼50％出现伤口明显溃烂，由此表明，gzl能够实现低抗生素浓度高效抗感染效果，且可能有一定促进伤口愈合的作用。