LAMP引物组合物及其应用的制作方法

本发明涉及微生物检测，尤其涉及一种用于检测志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌的lamp引物组合物及其应用。

背景技术：

1、志贺菌是人类细菌性痢疾的病原菌，其发病率和死亡率居感染性腹泻之首。福氏志贺菌和宋内志贺菌是流行志贺菌的主要型别。据估计，全球范围内约89.6％的志贺菌感染是由福氏志贺菌和宋内志贺菌造成的(livio s,strockbine na,panchalingam s,tennant sm,barry em,et al.shigella isolates from the global entericmulticenter study inform vaccine development.clin infect dis 2014；59:933941)。根据1991-2000年的统计数据显示，我国主要流行的志贺菌是福氏志贺菌，占比为86％，其中优势血清型为2a，占福氏分离株的80％；宋内志贺菌占12％(wang xy,tao f,xiao d,leeh,deen j,gong j,zhao y,zhou w,li w,shen b et al:trend and disease burden ofbacillary dysentery in china(1991-2000).bulletin of the world healthorganization 2006,84(7):561-568)。但是近年来，宋内志贺菌的分离率逐年上升，在一些省份，已经成为优势血清型。在一个基于全国哨点医院的2003年至2013年监测数据显示，在分离的2912株志贺菌中，福氏志贺菌为1610株，其中2a(n＝500,31.1％)和xv(n＝433,26.9％)血清型是福氏志贺菌的优势血清型；宋内志贺菌为1284株，占比为44.1％(qiu s,xu x,yang c,wang j,liang b,li p,li h,yi s,liu h,cui x et al:shift in serotypedistribution of shigella species in china,2003-2013.clinical microbiology andinfection:the official publication of the european society of clinicalmicrobiology and infectious diseases2015,21(3):252e255-268)。

2、肠侵袭性大肠埃希菌(enteroinvasive escherichia coli,eiec)是五类致泻性大肠埃希菌中的一种。eiec引起的腹泻的症状比志贺菌感染造成的腹泻要轻，但是这种病原菌在全球范围内都可检测到。尽管eiec的发病率较低，但eiec某些血清型可引起暴发事件(herzig cta,fleischauer at,lackey b,lee n,lawson t,et al.notes from thefield:enteroinvasive escherichia coli outbreak associated with a potluckparty-north carolina,june-july 2018.mmwr morb mortal wkly rep 2019；68:183184；pettengill ea,hoffmann m,binet r,roberts rj,payne j,et al.complete genomesequence of enteroinvasive escherichia coli o96:h19 associated with aseverefoodborne outbreak.genome announc 2015；3:e00883-15)。

3、因此快速有效的区分志贺菌和eiec，同时区分福氏和宋内志贺菌具有重要的公共卫生意义。

4、志贺菌和eiec亲缘关系很近，并有相似的表型特征和基因特征。如某些志贺菌和eiec都是没有动力，生化表型一致性很高。另外一些eiec菌株的o抗原与志贺菌o抗原有交叉如：o112ac，o124，o136，o143，o152和o164血清型(lan r,alles mc,donohoe k,martinezmb,reeves pr.molecular evolutionary relationships of enteroinvasiveescherichia coli and shigella spp.infect immun2004；72:50805088)。此外，志贺菌和eiec都携带致病性大质粒pinv和ipah基因，因此ipah基因这一志贺菌最常用的分子标签无法区分志贺菌和eiec。目前区分志贺菌和eiec主要基于生化反应和血清凝集，但是生化反应耗时长，且某些菌株的生化反应并不典型；血清凝集易受到细菌生长状态等条件的影响，且由于志贺菌和eiec存在血清上的交叉反应，结果判断并不准确(van den beld mj,reubsaet fa.differentiation between shigella,enteroinvasive escherichia coli(eiec)and noninvasive escherichia coli.european journal of clinicalmicrobiology&infectious diseases:official publication of the european societyof clinical microbiology 2012；31:899904)。除了表型方法，分子生物学方法也常用于志贺菌和eiec的区分，其中最常用的是lacy(lactose permease gene，乳糖渗透酶基因)基因，该基因在志贺菌中为阴性，在绝大部分的eiec中为阳性。基于该基因发展出来的普通pcr方法和荧光定量pcr方法广泛应用于区分志贺菌和eiec，但是该基因对于某些血清型的eiec，如o164血清型eiec的区分能力有限(horakova,k.,mlejnkova,h.and mlejnek,p.(2008),specific detection of escherichia coliisolated from water samplesusing polymerase chain reaction targeting four genes:cytochrome bd complex,lactose permease,β-d-glucuronidase,andβ-d-galactosidase.journal of appliedmicrobiology,105:970-976)。目前没有基于lacy基因的等温扩增方法用于区分志贺菌和eiec。

5、传统的区分福氏志贺菌和宋内志贺菌也是基于血清型方法。由于血清凝集方法本身的缺陷和血清的价格限制了基层实验室的应用，也达不到快速简便的要求。根据福氏志贺菌和宋内志贺菌血清型相关基因建立的普通pcr和荧光定量pcr方法用于福氏志贺菌和宋内志贺菌的区分和血清型鉴定，但是这些方法对于反应试剂要求较高，反应过程和结果判读多需要大型仪器，结果判读复杂，不利于基层推广使用(van den beld mjcde boerrf,reubsaet fag,rossen jwa,zhou kkuiling s,friedrich aw,kooistra-smid mamd2018.evaluation of aculture-dependent algorithm and a molecular algorithm foridentification of shigella spp.,escherichia coli,and enteroinvasive e.coli.jclin microbiol 56:10.1128/jcm.00510-18)。

6、另外，基于基因组的鉴定方法，通过构建志贺菌和eiec保守基因的进化树，可区分志贺菌和eiec，同时可以区分福氏志贺菌和宋内志贺菌(zhang,xiaomei&payne,michael&nguyen,thanh&kaur,sandeep&lan,ruiting.(2021).cluster-specific gene markersenhance shigella and enteroinvasive escherichia coliin silicoserotyping.microbial genomics.7.10.1099/mgen.0.000704)。但基因组鉴定方法需要对疑似菌株进行基因组进行序列测定，对于生物信息学和数据分析的计算能力有较高的要求。

7、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌的lamp引物组合物及其应用。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种lamp引物组合物，其包括如下引物：lacy-f3、lacy-b3、lacy-fip、lacy-bip和lacy-lb；lacy-f3、lacy-b3、lacy-fip、lacy-bip和lacy-lb的核苷酸序列依次如seq id no.06-10所示。

4、lacy-f3、lacy-b3、lacy-fip、lacy-bip和lacy-lb的靶基因为lacy。本发明首次提出针对lacy基因的lamp引物组合物，利用本发明提供的lamp引物组合物可快速、准确、特异地区分志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌，应用前景良好。

5、第二方面，本发明提供了所述lamp引物组合物在非疾病诊断目的的区分志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌中的应用。

6、第三方面，本发明提供了用于区分志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌的试剂盒，包括所述lamp引物组合物。

7、第四方面，本发明提供了非疾病诊断目的地区分志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌的方法，使用所述lamp引物组合物或者所述试剂盒对待测样品进行环介导核酸等温扩增，根据环介导核酸等温扩增结果判断待测样品中的菌种类别。

8、优选地，判断方法为：肠侵袭性大肠埃希菌的环介导核酸等温扩增结果为阳性，志贺菌的环介导核酸等温扩增结果为阴性。

9、第五方面，本发明提供了另外一种lamp引物组合物，其包括前面第一方面中所述的lamp引物组合物，还包括如下引物：ipah-f3、ipah-b3、ipah-fip、ipah-bip、ipah-lf、wzx-f3、wzx-b3、wzx-fip、wzx-bip、wzx-lf、wbg-f3、wbg-b3、wbg-fip、wbg-bip和wbg-lb；ipah-f3、ipah-b3、ipah-fip、ipah-bip、ipah-lf、wzx-f3、wzx-b3、wzx-fip、wzx-bip、wzx-lf、wbg-f3、wbg-b3、wbg-fip、wbg-bip和wbg-lb的核苷酸序列依次如seq id no.1-5、seqid no.11-20所示。

10、其中，ipah-f3、ipah-b3、ipah-fip、ipah-bip和ipah-lf的靶基因为ipah；wzx-f3、wzx-b3、wzx-fip、wzx-bip和wzx-lf的靶基因为wzx；wbg-f3、wbg-b3、wbg-fip、wbg-bip和wbg-lb的靶基因为wbgx。

11、本发明设计lacy基因的lamp引物，优化ipah和wbgx基因的lamp引物，将四个基因进行组合检测以实现快速、准确、特异的检测、区分志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌，同时区分大部分福氏和宋内志贺菌。本发明检测了四个lamp体系的灵敏度和特异性，验证了四个lamp体系的有效性，可有效区分志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌，并能够区分大部分福氏和宋内志贺菌，取得了良好的技术效果。

12、第六方面，本发明进一步提供了前面第五方面所述lamp引物组合物在非疾病诊断目的地区分如下a、b、c和d类菌种中的应用；a：肠侵袭性大肠埃希菌；b：福氏志贺菌1-5型；c：宋内志贺菌i型；d：福氏志贺菌6型和宋内志贺菌ii型志贺菌。

13、第七方面，本发明提供了用于区分如下a、b、c和d类菌种的试剂盒，a：肠侵袭性大肠埃希菌；b：福氏志贺菌1-5型；c：宋内志贺菌i型；d：福氏志贺菌6型和宋内志贺菌ii型志贺菌，其包括前面第五方面所述lamp引物组合物。

14、第八方面，本发明提供了非疾病诊断目的地区分如下a、b、c和d类菌种的方法，a：肠侵袭性大肠埃希菌；b：福氏志贺菌1-5型；c：宋内志贺菌i型；d：福氏志贺菌6型和宋内志贺菌ii型志贺菌，其使用前面第五方面所述lamp引物组合物或者第七方面所述试剂盒对待测样品进行环介导核酸等温扩增，根据环介导核酸等温扩增结果判断待测样品中的菌种类别。

15、优选地，判断方法为：肠侵袭性大肠埃希菌为ipah和lacy基因阳性，wzx和wbgx基因阴性；福氏志贺菌1-5型为ipah和wzx基因阳性，lacy和wbgx基因阴性；宋内志贺菌i型为ipah和wbgx基因阳性，lacy和wzx基因阴性，福氏志贺菌6型和宋内志贺菌ii型为ipah基因阳性，lacy、wbgx和wzx基因阴性。

16、本发明提供的方法具有操作简单、快速高效的优点，配置好反应体系后，加入水煮模版，61℃孵育60分钟后，肉眼即可观察结果。

17、本发明提供的方法具有高灵敏度和高特异性，四个基因对阳性标准菌株水煮模板的检测灵敏度均超过了100fg/μl。在41株常见肠道病原菌中检测结果均符合预期，证明方法特异性好。

18、本发明提供的方法不需要昂贵设备，仅需要61℃水浴箱即可实现反应。

19、有益效果：

20、本发明提供了一种用于检测志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌的lamp引物组合物及其应用。本发明提供的lamp引物组合物包括如下引物：lacy-f3、lacy-b3、lacy-fip、lacy-bip和lacy-lb；lacy-f3、lacy-b3、lacy-fip、lacy-bip和lacy-lb的核苷酸序列依次如seqid no.06-10所示。利用本发明提供的引物组合物可快速、准确、特异地区分志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌，应用前景良好。