一种靶向M细胞的PEDVCOE亚单位疫苗的制备方法及其应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种靶向m细胞的pedv coe亚单位疫苗的制备方法及其应用。

背景技术：

1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)引起的一种肠道传染病，病毒经过呼吸道和消化道黏膜入侵机体，主要表现为腹泻、呕吐和脱水。ped尚无特效药可治，疫苗免疫是最主要的防控手段。不同于经典g1型毒株，我国主要流行的毒株是g2型毒株，具有更高的致病力。但是，目前大多使用的通过皮下、肌肉或后海穴注射的灭活疫苗或弱毒疫苗无法直接诱导机体产生高效的黏膜免疫应答以抵御经呼吸道和消化道黏膜感染的pedv，故迫切需要开发安全性和免疫原性好的新型黏膜疫苗。

2、ped尚无特效药可治，目前通常采用灭活苗或弱毒苗接种的方式来预防此病。但是pedv灭活疫苗携带病毒核酸，有一定安全风险，制备弱毒疫苗在筛选合适的疫苗毒株时有一定的偶然性，且需要系统验证，成本太高又容易返祖，存在潜在感染的危险。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种融合蛋白。

2、本发明第二方面的目的，在于提供与本发明第一方面所述融合蛋白相关的生物材料。

3、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面所述融合蛋白或本发明第二方面所述的生物材料的应用。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种猪流行性腹泻病毒疫苗。

5、本发明第五方面的目的，在于提供本发明第四方面所述疫苗的制备方法。

6、本发明第六方面的目的，在于提供一种抗体的制备方法。

7、本发明所采取的技术方案是：

8、本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括pedv结构蛋白和m细胞靶向肽。

9、优选地，所述pedv结构蛋白包括pedv s蛋白。

10、优选地，所述pedv结构蛋白包括pedv s蛋白的coe区域。

11、优选地，所述pedv s蛋白核心中和表位的氨基酸序列如seq id no.1所示。

12、优选地，所述pedv s蛋白核心中和表位的编码基因如seq id no.2所示。

13、优选地，所述m细胞靶向肽的氨基酸序列如seq id no.6所示。

14、优选地，所述融合蛋白包括一个或多个m细胞靶向肽。

15、m细胞是黏膜免疫系统中一种特化的抗原转运细胞，散布于黏膜上皮细胞间，m细胞又称为微褶皱细胞，因其表面有许多微褶皱而得名，这些褶皱可以使得达到m细胞顶端表面的腔内抗原更好地被捕获，通过抗原提呈细胞(apc)的摄取、加工和提呈将抗原转运到下游淋巴组织并诱导机体产生黏膜免疫应答。m细胞基底部向顶部凹陷形成一个“口袋”状，在吞噬抗原过程中高度活跃，并将抗原转运给树突状细胞，进而进行抗原的处理并诱导产生一系列黏膜免疫应答。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(arg-gly-asp peptide，rgd肽)是一种可以对细胞进行有效黏附的肽，可用来定位或靶向某种特定细胞，能与整合素β1(integrinβ1)结合，而整合素β1在m细胞表面大量表达，因此可利用该特性来进行对m细胞的靶向。

16、优选地，所述融合蛋白还包括任选的协助表达和/或纯化的标签蛋白序列。

17、优选地，所述任选的协助表达和/或纯化和/或检测的标签蛋白序列包括但不限于(his)6、gst、mbp、flag、ha、strep、gfp、mcherry标签蛋白序列。

18、优选地，所述strep标签蛋白序列如seq id no.3所示。

19、优选地，所述gfp标签蛋白包括红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白。

20、优选地，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

21、优选地，所述标签蛋白序列为包含半胱氨酸的标签蛋白序列。

22、甲硫氨酸(methionine,met)与半胱氨酸(cysteine,cys)是仅有的两种天然含硫氨基酸，硫原子在催化、金属结合、氧化还原调节以及其他翻译后修饰中起到十分关键作用。其中，半胱氨酸的侧链有一个非常活跃的反应性巯基(-sh)，此基团中的的氢原子可很容易地被自由基和其他基团取代，因而易与其他分子形成共价键，并为之后对蛋白修饰加工等研究提供了良好的先决条件。

23、优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为：

24、a1)seq id no.8；或

25、a2)将seq id no.8经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与seqid no.8所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或

26、a3)与seq id no.8具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的同源性且与seq idno.8所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；

27、优选地，融合蛋白中pedv结构蛋白、m细胞靶向肽和/或标签蛋白序列等通过连接肽连接。

28、优选地，所述连接肽包括但不限于gss、gsgggs、ggggs、gggsggsg、gggggggg、ggsggsggsggs、ggggsggggsggggs、gsgggsggggsggggs。

29、本发明的第二方面，提供与本发明第一方面所述融合蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含a1)～a16)中至少一种：

30、a1)编码本发明第一方面所述的融合蛋白的核酸分子；

31、a2)包含a1)所述核酸分子的表达盒；

32、a3)包含a1)所述核酸分子的载体；

33、a4)包含a2)所述表达盒的载体；

34、a5)包含a1)所述核酸分子的转基因细胞系；

35、a6)包含a2)所述表达盒的转基因细胞系；

36、a7)包含a3)所述载体的转基因细胞系；

37、a8)包含a4)所述载体的转基因细胞系；

38、a9)包含a1)所述核酸分子的微生物；

39、a10)包含a2)所述表达盒的微生物；

40、a11)包含a3)所述载体的微生物；

41、a12)包含a4)所述载体的微生物；

42、a13)包含a1)所述核酸分子的病毒；

43、a14)包含a2)所述表达盒的病毒；

44、a15)包含a3)所述载体的病毒；

45、a16)包含a4)所述载体的病毒。

46、优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。

47、优选地，所述核酸分子的序列包含：

48、a1)seq id no.7；或

49、a2)与seq id no.7具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％的同源性且编码所述融合蛋白的核酸分子。

50、本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述融合蛋白或本发明第二方面所述的生物材料在以下任一项的应用：

51、b1)制备预防和/或治疗猪流行性腹泻的药物；

52、b2)抑制猪流行性腹泻病毒的药物；

53、b3)用于诱导猪流行性腹泻病毒抗原免疫反应的药物。

54、优选地，所述药物包括疫苗。

55、本发明的第四方面，提供一种疫苗，所述药物包含本发明第一方面所述的融合蛋白或本发明第二方面所述的生物材料。

56、优选地，所述疫苗还包括免疫学和药学上接受的载体或佐剂。

57、优选地，所述佐剂包括铝佐剂如氢氧化铝、磷酸铝，或角鲨烯水包油佐剂、也可以是脂质体佐剂或使用病毒载体表达的佐剂等，该佐剂是至少含有一种诱导机体产生免疫应答的激动剂。

58、优选地，所述免疫学和药学上接受的载体包括病毒和非病毒载体。

59、优选地，所述免疫学和药学上接受的病毒载体包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒或病毒样颗粒。

60、优选地，所述非病毒载体包括但不限于裸露dna、脂质体、纳米载体、外泌体。

61、优选地，所述纳米载体包括但不限于介孔二氧化硅-壳聚糖衍生物chi-c复合材料(ag/msn-chi)。

62、优选地，所述ag/msn-chi的制备方法为：将介孔二氧化硅与壳聚糖衍生物chi-c混合后离心，收集沉淀。

63、优选地，所述混合的条件为22～26℃，20～28h。

64、优选地，所述离心的条件为：离心转速为10000-16000rpm；和/或，离心时间8～15min。

65、优选地，所述介孔二氧化硅的制备包括但不限定于以下方法：将十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液与氢氧化钠溶液混合后加入正硅酸乙酯(teos)混合均匀，丙酮回流去除ctab胶束模板。

66、优选地，所述壳聚糖衍生物chi-c的制备方法包括但不限于以下方法：将壳聚糖溶液中添加3,4-二羟基苯基丙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳酰二亚胺(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)反应、透析。

67、本发明的第五方面，提供一种制备疫苗的方法，包括如下步骤：将本发明第一方面所述的融合蛋白和所述佐剂混匀，得到疫苗。

68、本发明的第六方面，提供一种抗体，所述抗体由本发明第一方面所述的融合蛋白或本发明第二方面所述的生物材料作为抗原诱导产生。

69、本发明的有益效果是：

70、本发明将靶向m细胞的rgd肽、pedv结构蛋白之一s蛋白上的核心中和表位coe区以及一种设计精良的折叠版本的gfp荧光蛋白sfgfp(superfolder gfp)进行连接后表达重组蛋白，并在该蛋白上引入含硫氨基酸cys便于后续实验对重组蛋白的修饰以及通过形成共价键的方式将蛋白连接到其他物质上，设计出一种安全有效的具有绿色荧光标记的黏膜亚单位疫苗。与普通疫苗不同，该疫苗的抗原不仅可以直接被树突细胞摄取，还能通过靶向m细胞将抗原提呈给树突状细胞，结合这两种摄取抗原的方式，抗原的提呈效率被显著提高，更有效的启动下游免疫进而诱导机体产生一系列免疫应答，使机体黏膜免疫系统产生大量pedv特异性抗体来抵御外来病原入侵，起到特异性免疫保护的效果。