2-氨基-3-甲基己酸的发酵生产方法

本发明涉及天然产物提取分离，主要涉及是2-氨基-3-甲基己酸的发酵生产方法。

背景技术：

1、农药是重要的农业生产资料，它可以防治有害生物、减轻植物病虫害，保证作物的安全，降低经济损失等，在作物的生长过程中发挥着重要作用。特定的农药还可以促进植物的生长和发育，进而提高作物的产量和品质。然而，长期、过度使用化学农药会导致环境污染、生态失衡、生物多样性降低等一系列危害(谭海军，2022)。同时，新型化学农药的研发难度和投入成本越来越高昂(lykogianni et al.,2021)。因此，研发安全环保的新型生物农药对确保农业生产安全至关重要。

2、2-氨基-3-甲基己酸，实验式为c7h15no2，分子量145克/摩尔，属于新型天然氨基酸类化合物，为无色透明晶体。1981年，sugiura等从粘质沙雷细菌(serratia marcescens)的α-氨基丁酸酯抗性突变体中分离得到2-氨基-3-甲基己酸，发现它是由异亮氨酸-缬氨酸生物合成途径酶经由α-酮戊酸合成的。1985年该团队又发现2-氨基-3-甲基己酸能抑制异亮氨酸生物合成，而且其对枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、大肠杆菌k-12(escherichiacoli k-12)有明显的抑制作用，对丁酸牛乳杆菌(achromobacter butyri)、产脲节杆菌(arthrobacter ureafaciens)、大肠杆菌b(e.coli b)和绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)有轻微抑制作用，但对产气杆菌(aerobacter aerogenes)、黄色短杆菌(brevibacterium helvolum)、荧光假单胞菌(p.fluorescens)和粘质沙雷氏菌(s.marcescens)没有抑制作用(sugiura等,1985)。

3、我们的最新研究表明，2-氨基-3-甲基己酸具有免疫激活剂的活性，能诱导植物抵抗病毒、真菌和细菌在叶片上的侵染；另一方面，2-氨基-3-甲基己酸能有效缓解高温、低温、干旱和盐渍对植物的造成的伤害，具有诱导植物抵抗非生物胁迫的活性(zl202011549486.6)。而且，2-氨基-3-甲基己酸能促进植物根茎叶生长发育、提高茶叶中茶氨酸等含量，具有促进植物生长和提高品质的功能(zl202110975196.6，zl202110795699.5)。此外，2-氨基-3-甲基己酸具有缓解作物药害的功能(专利申请号202311138238.6)。总之，2-氨基-3-甲基己酸是一种具有广阔应用前景的生物农药。

4、前期，申请人所在团队在申请号为201810359759.7的中国发明专利“一种烷基甘氨酸的合成方法”中公开了2-氨基-3-甲基己酸的化学合成方法，该方法是以n(二苯亚甲基)氨基乙腈为原料在催化剂二异丙氨基锂的作用下与2卤代烷发生取代反应而生产2-氨基-3-甲基己酸，但该方法化学合成过程需用到乙氰基三甲基硅烷等剧毒化合物、以及成本较高的金属催化剂—钯，而且该化学合成方法整体途径复杂，成本较高且产率低，不能满足工业化规模生产需求。因此，转向探索生物合成2-氨基-3-甲基己酸的方法。

5、最近，我们发现稻瘟菌和几种链格孢菌(alternata sp.)都能产生2-氨基-3-甲基己酸，尤其紫茎泽兰致病型链格孢菌菌丝中含量最高，可以达到4.04mg/kg fw，通过添加苏氨酸的方法可以提升2-氨基-3-甲基己酸产量到22mg/kg fw，但该产率仍然无法满足工业化生产要求(wang等,2022)。此外，有报道显示生产水蛭素类似物的大肠杆菌工程菌也能合成少量副产物2-氨基-3-甲基己酸(muramatsu等，2002；reitz等，2018)。根据早前报道，野生型粘质沙雷氏菌不能产生2-氨基-3-甲基己酸，但生长在含有正缬氨酸和亮氨酸的特殊培养基中可以产生较高水平的2-氨基-3-甲基己酸，产量达0.5mg/ml(sugiura等,1981)。但是，此研究中用于生产2-氨基-3-甲基己酸的粘质沙雷氏菌为异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸生物合成酶的低表达的特殊条件突变体，该菌株为特殊菌株，不易获得，且不适合大规模生产；其次，利用该条件突变体生产2-氨基-3-甲基己酸需要向培养基中加入10mg/ml的正缬氨酸。正缬氨酸的市场价格为55-65元/千克，与其他天然氨基酸相比价格昂贵，难以达到低成本大规模生产2-氨基-3-甲基己酸的预期。

6、粘质沙雷氏菌又称灵杆菌，是一种可以产生鲜红色素的细菌，其广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群。由于其野生型菌株资源丰富、易于获得，我们从不同野生型粘质沙雷氏菌菌株入手，先筛选出生产2-氨基-3-甲基己酸的优势候选菌株，然后通过优化培养基及发酵工艺并结合添加不同前体物，最后建立满足工业化生产需求的安全高效的2-氨基-3-甲基己酸发酵生产工艺。以上正是本专利的创新之处。

技术实现思路

1、本发明的目的是通过分析不同菌株、不同基质及不同培养条件下s.marcescens发酵生产2-氨基-3-甲基己酸的能力，建立液体发酵小试工艺和产物分离纯化流程，为2-氨基-3-甲基己酸的规模化生产提供理论依据和技术支持。

2、本发明的目的可通过以下技术方案实现：2-氨基-3-甲基己酸的发酵生产方法，以菌种编号为cmgcc 1.12941的serratia marcescens为发酵菌株，在基础液体培养基中添加前体氨基酸进行发酵生产2-氨基-3-甲基己酸，发酵条件为初始ph范围为6.8-7.2，接种量为2％-6％，转速为180-220rpm，通气量为250-350l/h，所述的基础液体培养基配方为无水葡萄糖18-22g/l、尿素8-12g/l、磷酸氢二钾0.5-1.5g/l、七水合硫酸镁0.4-0.7g/l、玉米浆干粉8-11g/l；所述的前体氨基酸为苏氨酸，添加量为10-20g/l。

3、作为本发明的一种优选，发酵条件为初始ph为7.2、接种量6％、搅拌转速180rpm、通气量350l/h。

4、作为本发明的一种优选，所述的基础液体培养基配方为无水葡萄糖20g/l、尿素10g/l、磷酸氢二钾1.0g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、玉米浆干粉10g/l。

5、作为本发明的一种优选，所述的苏氨酸添加量为10g/l。

6、作为本发明的一种优选，所述的生产方法还包括用离子交换树脂层析法对发酵培养液中的2-氨基-3-甲基己酸进行分离纯化。

7、作为本发明的进一步优选，当用离子交换树脂进行纯化时，采用钠型732阳离子交换树脂，用质量分数为0.75％浓度的氨水溶液进行梯度洗脱。

8、作为本发明的一种优选，所述的生产方法还包括用液相色谱对发酵培养液中的2-氨基-3-甲基己酸进行分离纯化。

9、作为本发明的进一步优选，当用液相色谱进行纯化时，采用制备色谱，以水-乙腈或水-甲醇洗脱体系，制备色谱柱为c18柱，紫外检测波长为210nm，每次进样量为1ml，流速为2ml/min。

10、以上两种分离方法均可得到高纯度的2-氨基-3-甲基己酸(纯度＞99％)。

11、筛选s.marcescens的最佳发酵菌株作为2-氨基-3-甲基己酸的发酵生产菌株、优化培养基成分、向改良后的培养基中加入前体氨基酸、以及探索液体发酵工艺的最佳条件来最大限度的提高2-氨基-3-甲基己酸的产量。主要包括以下步骤：

12、1、使用从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的5株s.marcescens菌株(菌株编号分别为：cmgcc 1.2794、cmgcc 1.12941、cmgcc 1.1210、cmgcc 1.646、cmgcc 1.589)分别进行发酵2-氨基-3-甲基己酸，通过高效液相色谱法比较发酵所得的2-氨基-3-甲基己酸的含量，从中筛选出最佳发酵菌株cmgcc 1.12941。

13、2、使用筛选出的最佳发酵菌株cmgcc 1.12941进行发酵2-氨基-3-甲基己酸，通过优化培养基中玉米浆的含量和添加的前体氨基酸来提高目标产物2-氨基-3-甲基己酸含量，得到结果最佳培养基的配方中玉米浆含量为10g/l，最佳前体氨基酸为苏氨酸，最佳添加量为10g/l。

14、3、根据前面试验结论得出的最佳菌株和培养基组分，在小试发酵罐中进一步优化s.marcescens液体发酵生产过程的四项技术参数：发酵初始ph、接种量、转速和通气量，设置初始ph范围为6.8-7.2，接种量为2％-6％，转速为180-220rpm，通气量为250-350l/h，在上述发酵条件下对发酵条件进行优化，通过正交试验得出2-氨基-3-甲基己酸液体发酵工艺的最佳发酵参数为初始ph为7.2、接种量6％、搅拌转速180rpm、通气量350l/h，在该最佳条件下，2-氨基-3-甲基己酸的10l发酵罐产量为1595.28mg/l。

15、技术先进性和有益效果

16、本发明提供了一种2-氨基-3-甲基己酸液体发酵生产工艺方法，其先进性包括(1)发酵生产2-氨基-3-甲基己酸的菌株为易获得的野生型粘质沙雷氏菌；(2)本发明在现有培养基的基础上对其中的配方进行优化，改善了粘质沙雷氏菌的生长情况；(3)在改良的培养基中添加价格低廉的前体氨基酸—苏氨酸，2-氨基-3-甲基己酸产量是目前研究的3倍以上，进一步降低了生产成本，通过液体发酵并利用离子交换树脂柱层析法或液相色谱分离法纯化后，得到目标化合物。与已有的研究相比，此方法克服了需要构建突变体菌株、或添加价格高昂的正缬氨酸的问题，具有发酵菌种易获得、生产成本更低、工艺流程简单、产量更高的特点，能够满足工业化生产和农药生产用药需求，具有较高的潜在价值和广阔的应用前景。