一种具有抗氧化、抗衰老功效的低聚原花青素及其制备方法与流程

本发明涉及医药和化妆品领域，具体涉及一种抗氧化、抗衰老的低聚原花青素及其应用。

背景技术：

1、按照聚合度大小，原花青素可分为低聚原花青素(2-4聚体)和多聚原花青素(≥5聚体)。原花青素的聚合度大小对其抗氧化性影响较大，一些低聚花青素在抗氧化、清除自由基、抗衰老等方面具有显著的活性，同时易被皮肤吸收。聚合度的增加不仅抗氧化作用降低，也会因空间位阻降低皮肤摄取。

2、相应的多聚原花青素具有更高的稳定性，植物中以及市售的植物提取物中多为多聚原花青素。多聚原花青素通过生物酶、酸解等可制备得到低聚原花青素。酶解会导致后续除杂成本的增加，而如专利cn201210311225.x使用盐酸、柠檬酸、醋酸、抗坏血酸、苹果酸、酒石酸、没食子酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、亚硫酸等进行酸解，一方面如盐酸浓度控制不当会导致产物的进一步降解；另一方面，在酸解过程中，活性基团可能受亲核攻击，引入不必要的官能团。

3、满足化妆品抗氧化、抗衰老需求的低聚原花青素原料。

技术实现思路

1、发明人研究发现，酸水解多聚原花青素以制备低聚原花青素时，如果使用强酸如盐酸等，水解产物中含大量的花青素，抗氧化活性差。发明人假设，使用酸性氨基酸如天门冬氨酸或谷氨酸代替盐酸时，酸性弱于盐酸，有望既能达到酸解的ph值又可以减少过度酸解。即帮助断裂多聚原花青素的大分子结构，生成较小的低聚物。这种酸性环境有助于控制降解速率和降解程度，可能使得最终产物保留更多的有益结构。另外，发明人测试后惊讶地发现，苏氨酸这种中性氨基酸对于反应很重要，苏氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸单独或者两者混合以催化水解多聚原花青素时，产物的产量、抗氧化活性均无明显优势，但苏氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸三元体系在以某些多聚原花青素为反应原料时低聚原花青素产物的产量、抗氧化活性均明显改善，进而得到本发明。

2、在本发明的第一方面，提供一种低聚原花青素，其特征在于，所述低聚原花青素的制备方法包含以下步骤：

3、(1)将多聚原花青素加入到苏氨酸水溶液中，搅拌均匀，然后加入天门冬氨酸和谷氨酸，超声反应；

4、(2)透析和/或纳滤，得到低聚原花青素溶液，冷冻干燥，即得。

5、在本发明的一些实施方案中，所述苏氨酸的浓度为0.1-300g/l。在本发明的一些实施方案中，所述谷氨酸的浓度为0.1-300g/l。在本发明的一些实施方案中，所述天门冬氨酸的浓度为0.1-300g/l。

6、在本发明的一些实施方案中，所述苏氨酸的浓度为10-30g/l。在本发明的一些实施方案中，所述谷氨酸的浓度为1-3g/l。在本发明的一些实施方案中，所述天门冬氨酸的浓度为1-2g/l。

7、在本发明的一些实施方案中，所述苏氨酸的浓度为10-30g/l，所述谷氨酸的浓度为1-3g/l，所述天门冬氨酸的浓度为1-2g/l。即所述苏氨酸分散于(溶于)水中后的浓度为10-30g/l，所述谷氨酸分散于(溶于)水中后的浓度为1-3g/l，所述天门冬氨酸分散于(溶于)水中后的浓度为1-2g/l。下同。

8、在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中的多聚原花青素分散于水中后的浓度为3-7g/l。

9、在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中的超声反应开始时，所述苏氨酸的浓度为20g/l；所述谷氨酸的浓度为2g/l；所述天门冬氨酸的浓度为1.5g/l，所述多聚原花青素的浓度为5g/l。即，在本发明的一些实施方案中，所述苏氨酸的浓度为20g/l；所述谷氨酸的浓度为2g/l；所述天门冬氨酸的浓度为1.5g/l，所述多聚原花青素的浓度为5g/l。

10、在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自葡萄籽、葡萄、苹果、紫米、黑米、栀子、迷迭香、木瓜、荔枝、啤酒花、龙眼、沙棘、余甘子、桂皮、高粱、荞麦、枇杷、樱桃、石榴、紫甘薯、越橘、莲蓬、猕猴桃、杨梅、榛子、合欢、银杏、核桃、澳洲坚果、柏树、木榄树、木荷、桦树、桉树、杨树、樟树、栗树、栎树、黑荆树中的1种、2种或者多种。

11、在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自葡萄籽、紫米或黑米。

12、在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自葡萄籽。在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自紫米。在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自黑米。在本发明的一些实施方案中，所述葡萄籽来自金香葡萄。

13、在本发明的一些实施方案中，所述透析和/或纳滤的截留分子量为1500-2000da、300da。在本发明的一些实施方案中，所述透析的截留分子量为1500-2000da。在本发明的一些实施方案中，所述透析的截留分子量为1500da。在本发明的一些实施方案中，所述透析的截留分子量为2000da。在本发明的一些实施方案中，所述透析的截留分子量为300da。

14、本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用纳滤膜过滤。

15、本发明的一些实施方案中，所述纳滤的截留分子量为1500-2000da。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤的截留分子量为1500da。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤的截留分子量为2000da。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤的截留分子量为300da。

16、本发明的一些实施方案中，所述纳滤使用risingsun nf7纳滤膜过滤。本发明的一些实施方案中，所述纳滤使用risingsun nf2纳滤膜过滤。

17、在本发明的一些实施方案中，所述透析和/或纳滤为使用滤膜处理，得到分子量300-1500da的溶质的溶液。在本发明的一些实施方案中，所述透析为使用滤膜处理，得到分子量300-1500da的溶质的溶液。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用滤膜处理，得到分子量300-1500da的溶质的溶液。

18、在本发明的一些实施方案中，所述透析和/或纳滤为使用滤膜处理，得到分子量300-2000da的溶质的溶液。在本发明的一些实施方案中，所述透析为使用滤膜处理，得到分子量300-2000da的溶质的溶液。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用滤膜处理，得到分子量300-2000da的溶质的溶液。

19、在本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用滤膜处理，使得溶液仅保留分子量300-1500da的溶质。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用滤膜处理，使得溶液仅保留分子量300-2000da的溶质。在本发明的一些实施方案中，所述透析为使用滤膜处理，使得溶液仅保留分子量300-1500da的溶质。在本发明的一些实施方案中，所述透析为使用滤膜处理，使得溶液仅保留分子量300-2000da的溶质。

20、本发明的一些实施方案中，所述超声功率为300-700w。优选为500w。本发明的一些实施方案中，所述超声功率为500w。

21、本发明的一些实施方案中，所述超声反应在冰水浴中进行。

22、本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为0.5-3h。本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为0.5-2h。本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为1h。本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为2h。本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为0.5h。

23、本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素的制备方法包含以下步骤：称取植物原料，粉碎并过筛，用石油醚浸泡以脱脂，过滤；加入60％乙醇(v/v)后静置，过滤，除去滤液的溶剂，向其中加入水，充分搅拌以分散均匀，然后加入乙醇，沉淀除去蛋白质、多糖等杂质；过滤，除去滤液的溶剂，5℃下向其中加入水，充分搅拌以分散均匀，然后加入乙酸乙酯萃取，取水相，蒸干溶剂，得到多聚原花青素。

24、本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素按以下步骤制备得到：称取植物原料，粉碎并过筛，用石油醚浸泡以脱脂，过滤；加入60％乙醇(v/v)后静置，过滤，除去滤液的溶剂，向其中加入水，充分搅拌以分散均匀，然后加入乙醇，沉淀除去蛋白质、多糖等杂质；过滤，除去滤液的溶剂，5℃下向其中加入水，充分搅拌以分散均匀，然后加入乙酸乙酯萃取，取水相，蒸干溶剂，得到多聚原花青素。

25、本发明的一些实施方案中，所述低聚原花青素的制备方法包含以下步骤：

26、(a)多聚原花青素的制备：称取20g葡萄籽、紫米或黑米，粉碎并过筛，用1000ml石油醚浸泡30h以脱脂；过滤，将滤渣自然风干；向其中加入800ml的60％乙醇(v/v)，密闭条件下25℃静置3d；过滤，将滤液在30℃下减压旋干；向其中加入100ml水，充分搅拌以分散均匀，然后加入500ml乙醇，沉淀除去蛋白质、多糖等杂质；过滤，将滤液在30℃下减压旋干；5℃下向其中加入1000ml水，充分搅拌以分散均匀，然后加入200ml乙酸乙酯萃取，取水相，30℃减压旋干，得到葡萄籽、紫米或黑米来源的多聚原花青素；

27、(b)多聚原花青素制备低聚原花青素产物：取如(a)所述方法制备得到的多聚原花青素5g，加入到苏氨酸的1000ml水溶液中，搅拌均匀，然后加入2.0g谷氨酸和1.5g天门冬氨酸，搅拌溶解，冰水浴中500w超声反应1h；使用截留分子量为1500-2000da的纳滤膜过滤，滤液再用截留分子量为300da的纳滤膜过滤，将滤液冷冻干燥，得到低聚原花青素产物。

28、本发明的一些实施方案中，所述制备方法包含以下步骤或所述制备方法步骤如下：

29、(a)多聚原花青素的制备：称取20g葡萄籽，粉碎并过筛，用1000ml石油醚浸泡30h以脱脂；过滤，将滤渣自然风干；向其中加入800ml的60％乙醇(v/v)，密闭条件下25℃静置3d；过滤，将滤液在30℃下减压旋干；向其中加入100ml水，充分搅拌以分散均匀，然后加入500ml乙醇，沉淀除去蛋白质、多糖等杂质；过滤，将滤液在30℃下减压旋干；5℃下向其中加入1000ml水，充分搅拌以分散均匀，然后加入200ml乙酸乙酯萃取，取水相，30℃减压旋干，得到葡萄籽来源的多聚原花青素；

30、(b)多聚原花青素制备低聚原花青素产物：取如(a)所述方法制备得到的多聚原花青素5g，加入到苏氨酸的1000ml水溶液中，搅拌均匀，然后加入2.0g谷氨酸和1.5g天门冬氨酸，搅拌溶解，冰水浴中500w超声反应1h；使用截留分子量为1500-2000da的纳滤膜过滤，滤液再用截留分子量为300da的纳滤膜过滤，将滤液冷冻干燥，得到低聚原花青素产物。

31、本发明的一些实施方案中，所述制备方法包含实施例一所述的步骤。

32、在本发明的第二方面，提供一种低聚原花青素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含本发明第一发明所述的步骤。

33、本发明的一些实施方案中，提供一种低聚原花青素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含以下步骤：

34、(1)将多聚原花青素加入到苏氨酸水溶液中，搅拌均匀，然后加入天门冬氨酸和谷氨酸，超声反应；

35、(2)透析和/或纳滤，得到低聚原花青素溶液，冷冻干燥，即得。

36、在本发明的一些实施方案中，所述苏氨酸的浓度为10-30g/l，所述谷氨酸的浓度为1-3g/l，所述天门冬氨酸的浓度为1-2g/l。即所述苏氨酸分散于(溶于)水中后的浓度为10-30g/l，所述谷氨酸分散于(溶于)水中后的浓度为1-3g/l，所述天门冬氨酸分散于(溶于)水中后的浓度为1-2g/l。下同。

37、在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中的多聚原花青素分散于水中后的浓度为3-7g/l。

38、在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中的超声反应开始时，所述苏氨酸的浓度为20g/l；所述谷氨酸的浓度为2g/l；所述天门冬氨酸的浓度为1.5g/l，所述多聚原花青素的浓度为5g/l。即，在本发明的一些实施方案中，所述苏氨酸的浓度为20g/l；所述谷氨酸的浓度为2g/l；所述天门冬氨酸的浓度为1.5g/l，所述多聚原花青素的浓度为5g/l。

39、在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自葡萄籽、葡萄、苹果、紫米、黑米、栀子、迷迭香、木瓜、荔枝、啤酒花、龙眼、沙棘、余甘子、桂皮、高粱、荞麦、枇杷、樱桃、石榴、紫甘薯、越橘、莲蓬、猕猴桃、杨梅、榛子、合欢、银杏、核桃、澳洲坚果、柏树、木榄树、木荷、桦树、桉树、杨树、樟树、栗树、栎树、黑荆树中的1种、2种或者多种。

40、在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自葡萄籽、紫米或黑米。

41、在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自葡萄籽。在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自紫米。在本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素提取自黑米。在本发明的一些实施方案中，所述葡萄籽来自金香葡萄。

42、在本发明的一些实施方案中，所述透析和/或纳滤的截留分子量为1500-2000da、300da。在本发明的一些实施方案中，所述透析的截留分子量为1500-2000da。在本发明的一些实施方案中，所述透析的截留分子量为1500da。在本发明的一些实施方案中，所述透析的截留分子量为2000da。在本发明的一些实施方案中，所述透析的截留分子量为300da。

43、本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用纳滤膜过滤。

44、本发明的一些实施方案中，所述纳滤的截留分子量为1500-2000da。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤的截留分子量为1500da。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤的截留分子量为2000da。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤的截留分子量为300da。

45、本发明的一些实施方案中，所述纳滤使用risingsun nf7纳滤膜过滤。本发明的一些实施方案中，所述纳滤使用risingsun nf2纳滤膜过滤。

46、在本发明的一些实施方案中，所述透析和/或纳滤为使用滤膜处理，得到分子量300-1500da的溶质的溶液。在本发明的一些实施方案中，所述透析为使用滤膜处理，得到分子量300-1500da的溶质的溶液。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用滤膜处理，得到分子量300-1500da的溶质的溶液。

47、在本发明的一些实施方案中，所述透析和/或纳滤为使用滤膜处理，得到分子量300-2000da的溶质的溶液。在本发明的一些实施方案中，所述透析为使用滤膜处理，得到分子量300-2000da的溶质的溶液。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用滤膜处理，得到分子量300-2000da的溶质的溶液。

48、在本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用滤膜处理，使得溶液仅保留分子量300-1500da的溶质。在本发明的一些实施方案中，所述纳滤为使用滤膜处理，使得溶液仅保留分子量300-2000da的溶质。在本发明的一些实施方案中，所述透析为使用滤膜处理，使得溶液仅保留分子量300-1500da的溶质。在本发明的一些实施方案中，所述透析为使用滤膜处理，使得溶液仅保留分子量300-2000da的溶质。

49、本发明的一些实施方案中，所述超声功率为300-700w。优选为500w。

50、本发明的一些实施方案中，所述超声反应在冰水浴中进行。

51、本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为0.5-3h。本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为0.5-2h。本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为1h。本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为2h。本发明的一些实施方案中，所述超声反应的时间为0.5h。

52、本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素的制备方法包含以下步骤：称取植物原料，粉碎并过筛，用石油醚浸泡以脱脂，过滤；加入60％乙醇(v/v)后静置，过滤，除去滤液的溶剂，向其中加入水，充分搅拌以分散均匀，然后加入乙醇，沉淀除去蛋白质、多糖等杂质；过滤，除去滤液的溶剂，5℃下向其中加入水，充分搅拌以分散均匀，然后加入乙酸乙酯萃取，取水相，蒸干溶剂，得到多聚原花青素。

53、本发明的一些实施方案中，所述多聚原花青素按以下步骤制备得到：称取植物原料，粉碎并过筛，用石油醚浸泡以脱脂，过滤；加入60％乙醇(v/v)后静置，过滤，除去滤液的溶剂，向其中加入水，充分搅拌以分散均匀，然后加入乙醇，沉淀除去蛋白质、多糖等杂质；过滤，除去滤液的溶剂，5℃下向其中加入水，充分搅拌以分散均匀，然后加入乙酸乙酯萃取，取水相，蒸干溶剂，得到多聚原花青素。

54、本发明的一些实施方案中，所述制备方法包含以下步骤：

55、(a)多聚原花青素的制备：称取20g葡萄籽、紫米或黑米，粉碎并过筛，用1000ml石油醚浸泡30h以脱脂；过滤，将滤渣自然风干；向其中加入800ml的60％乙醇(v/v)，密闭条件下25℃静置3d；过滤，将滤液在30℃下减压旋干；向其中加入100ml水，充分搅拌以分散均匀，然后加入500ml乙醇，沉淀除去蛋白质、多糖等杂质；过滤，将滤液在30℃下减压旋干；5℃下向其中加入1000ml水，充分搅拌以分散均匀，然后加入200ml乙酸乙酯萃取，取水相，30℃减压旋干，得到葡萄籽、紫米或黑米来源的多聚原花青素；

56、(b)多聚原花青素制备低聚原花青素产物：取如(a)所述方法制备得到的多聚原花青素5g，加入到苏氨酸的1000ml水溶液中，搅拌均匀，然后加入2.0g谷氨酸和1.5g天门冬氨酸，搅拌溶解，冰水浴中500w超声反应1h；使用截留分子量为1500-2000da的纳滤膜过滤，滤液再用截留分子量为300da的纳滤膜过滤，将滤液冷冻干燥，得到低聚原花青素产物。

57、本发明的一些实施方案中，所述制备方法包含以下步骤：

58、(a)多聚原花青素的制备：称取20g葡萄籽，粉碎并过筛，用1000ml石油醚浸泡30h以脱脂；过滤，将滤渣自然风干；向其中加入800ml的60％乙醇(v/v)，密闭条件下25℃静置3d；过滤，将滤液在30℃下减压旋干；向其中加入100ml水，充分搅拌以分散均匀，然后加入500ml乙醇，沉淀除去蛋白质、多糖等杂质；过滤，将滤液在30℃下减压旋干；5℃下向其中加入1000ml水，充分搅拌以分散均匀，然后加入200ml乙酸乙酯萃取，取水相，30℃减压旋干，得到葡萄籽来源的多聚原花青素；

59、(b)多聚原花青素制备低聚原花青素产物：取如(a)所述方法制备得到的多聚原花青素5g，加入到苏氨酸的1000ml水溶液中，搅拌均匀，然后加入2.0g谷氨酸和1.5g天门冬氨酸，搅拌溶解，冰水浴中500w超声反应1h；使用截留分子量为1500-2000da的纳滤膜过滤，滤液再用截留分子量为300da的纳滤膜过滤，将滤液冷冻干燥，得到低聚原花青素产物。

60、本发明的一些实施方案中，所述制备方法包含实施例一所述的步骤。

61、在本发明的第三方面，提供如第一方面所述的低聚原花青素在制备抗氧化或抗衰老的药物或化妆品中的应用。

62、本发明的一些实施方案中，提供如第一方面所述的低聚原花青素在制备抗衰老的药物中的应用。本发明的一些实施方案中，提供如第一方面所述的低聚原花青素在制备抗氧化的药物中的应用。本发明的一些实施方案中，提供如第一方面所述的低聚原花青素在制备减少自由基的药物中的应用。本发明的一些实施方案中，提供如第一方面所述的低聚原花青素在制备延缓衰老的药物中的应用。

63、本发明的一些实施方案中，提供如第一方面所述的低聚原花青素在制备抗衰老的化妆品中的应用。本发明的一些实施方案中，提供如第一方面所述的低聚原花青素在制备抗氧化的化妆品中的应用。本发明的一些实施方案中，提供如第一方面所述的低聚原花青素在制备减少自由基的化妆品中的应用。本发明的一些实施方案中，提供如第一方面所述的低聚原花青素在制备延缓衰老的化妆品中的应用。

64、本发明的技术方案的技术效果：反应流程所用的物质的安全性高，除杂成本低。

65、使用谷氨酸、天门冬氨酸和苏氨酸的三元体系，通过提供这种更加温和的降解途径，有助于获得更高活性的低聚原花青素产品。这些低聚物在结构上更适合作为抗氧化剂和抗衰老剂，从而展现出比其他方法的低聚原花青素产物更好的生物活性。