一种舒肝平胃丸中八种化学成分含量测定方法

本发明属于中药质量控制领域，尤其涉及一种舒肝平胃丸中八种化学成分的含量测定方法。

背景技术：

1、舒肝平胃丸由姜厚朴、陈皮、麸炒枳壳、法半夏、苍术、炙甘草和焦槟榔等七味中药组成，功效舒肝和胃，化湿导滞，用于治疗肝胃不和、湿浊中阻所致的胸胁胀满、胃脘痞塞疼痛、嘈杂嗳气、呕吐酸水。

2、舒肝平胃丸在现行2020年版《中国药典》的质量标准中仅以厚朴酚及和厚朴酚为含量测定指标，由于舒肝平胃丸处方药材多，化学成分复杂，仅靠对单一化合物进行鉴别或含测，无法全面反映舒肝平胃丸的物质基础和化学成分群的整体性和复杂性，难以全面控制其内在质量。中药指纹图谱具有整体、宏观、模糊分析等特点，可通过对中药整体特征的描述，达到整体质量控制的目的。

3、在已有文献报道的质控方法中建立的舒肝平胃丸hplc指纹图谱，21个共有峰仅有5个经对照品准确化学指认，且分析时间长（121.74min），难以实现舒肝平胃丸的整体质量控制。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种同时测定舒肝平胃丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及和厚朴酚的含量测定方法。本方法采用超高效液相色谱法（uplc），通过对样品处理方法、色谱方法的优化，建立了舒肝平胃丸活性成分含量测定的方法，为该药物质量标准的制定提供研究基础。所述测定方法具有分析速度快、准确度高、灵敏度高、重复性好、节约溶剂的优点，为进一步完善和提升舒肝平胃丸的质量控制体系提供依据。

2、本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：

3、一种舒肝平胃丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及和厚朴酚的含量测定方法，所述含量测定方法为：

4、色谱条件：采用规格为2.1mm×100mm，1.8μm的waters acquity uplc hss t3色谱柱，柱温32～38℃，以乙腈为流动相a，以体积分数0.2%的甲酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱，流速为0.3～0.5ml/min，检测波长为245～325nm，进样量为1～4μl。

5、对照品溶液的制备：精密称取对照品甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及和厚朴酚溶解于纯甲醇中，得到一定浓度的对照品储备液；分别精密量取一定量所述对照品储备液加溶剂稀释，得混合对照品溶液。

6、供试品溶液的制备：取舒肝平胃丸，研细，取2～6g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入50%～100%甲醇30～40ml，加热回流50～70分钟，抽滤，精密加入50%～100%甲醇20～30ml，加热回流20～40分钟，抽滤，两次滤液合并定容到50ml容量瓶，滤膜滤过，取续滤液，即得。

7、含量测定：精密吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即可。

8、前述的舒肝平胃丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及和厚朴酚的含量测定方法中，所述的梯度洗脱程序为：0～2min，流动相a的体积分数变化为4%～5%，流动相b的体积分数变化为96%～95%；2～4min，流动相a的体积分数变化为5%～10%，流动相b的体积分数变化为95%～90%；4～7min，流动相a的体积分数变化为10%～12%，流动相b的体积分数变化为90%～88%；7～14min，流动相a的体积分数变化为12%～19%，流动相b的体积分数变化为88%～81%；14～17min，流动相a的体积分数为19%～23%，流动相b的体积分数变化为81%～77%；17～22min，流动相a的体积分数为23%～30%，流动相b的体积分数变化为77%～70%；22～34min，流动相a的体积分数为30%～36%，流动相b的体积分数变化为70%～64%；34～45min，流动相a的体积分数为36%～44%，流动相b的体积分数变化为64%～56%；45～55min，流动相a的体积分数为44%～57%，流动相b的体积分数变化为56%～43%；55～62min，流动相a的体积分数为57%～75%，流动相b的体积分数变化为43%～25%；62～65min，流动相a的体积分数为75%～90%，流动相b的体积分数变化为25%～10%；65～70min，流动相a的体积分数为90%，流动相b的体积分数变化为10%。

9、前述的舒肝平胃丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及和厚朴酚的含量测定方法中，所述供试品溶液的制备方法为：取舒肝平胃丸，研细，取4.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇40ml，加热回流1小时，抽滤，精密加入甲醇20ml，加热回流30分钟，抽滤，两次滤液合并定容到50ml容量瓶，滤膜滤过，取续滤液，即得。

10、前述的舒肝平胃丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及和厚朴酚的含量测定方法中，所述柱温为38℃，流速为0.4ml/min，检测波长为245,276,284,292,315,325nm，进样量为3μl。

11、发明人进行了大量的实验研究，以下是部分实验研究。

12、实验例1 含量测定方法考察

13、1 仪器与试药

14、waters acquity i class超高效液相色谱仪（美国waters公司）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；skm调温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）；千分之一天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；电子天平（上海菁海仪器有限公司）。

15、乙醇（分析级，天津市大茂化学试剂厂）；甲醇（色谱级，山东禹王和天下新材料有限公司）；乙腈（色谱级，默克股份两合公司）；甲酸（lc-ms，默克股份两合公司）；试验用水为屈臣氏水。

16、甘草苷（must-14100910，纯度98.68%）、柚皮苷（批号must-22062911，纯度98.12%）、橙皮苷（must-21042811，纯度98.88%）、新橙皮苷（must-22072810，纯度98.63%）、异甘草苷（must-19052501，纯度99.31%）、甘草素（must-19101611，纯度99.66%）、异甘草素（must-20031903，纯度99.43%）和和厚朴酚（must-23022119，纯度99.37%），均购自成都曼思特生物科技有限公司，40批舒肝平胃丸样品来源信息见表1。

17、表1 40批舒肝平胃丸样品来源信息

18、 编号 厂家 批号 规格 s1 内蒙古九郡药业有限责任公司 221106 水丸，4.5克×12袋/盒 s2 内蒙古九郡药业有限责任公司 221106 水丸，4.5克×12袋/盒 s3 内蒙古九郡药业有限责任公司 221106 水丸，4.5克×12袋/盒 s4 内蒙古九郡药业有限责任公司 230310 水丸，4.5克×12袋/盒 s5 内蒙古九郡药业有限责任公司 230310 水丸，4.5克×12袋/盒 s6 内蒙古九郡药业有限责任公司 230310 水丸，4.5克×12袋/盒 s7 内蒙古九郡药业有限责任公司 230310 水丸，4.5克×12袋/盒 s8 内蒙古九郡药业有限责任公司 230310 水丸，4.5克×12袋/盒 s9 内蒙古九郡药业有限责任公司 230310 水丸，4.5克×12袋/盒 s10 内蒙古九郡药业有限责任公司 220314 水丸，4.5克×10袋/盒 s11 内蒙古九郡药业有限责任公司 220601 水丸，4.5克×10袋/盒 s12 内蒙古九郡药业有限责任公司 220601 水丸，4.5克×10袋/盒 s13 内蒙古九郡药业有限责任公司 221009 水丸，4.5克×10袋/盒 s14 内蒙古九郡药业有限责任公司 221009 水丸，4.5克×10袋/盒 s15 内蒙古九郡药业有限责任公司 221010 水丸，4.5克×10袋/盒 s16 内蒙古九郡药业有限责任公司 221010 水丸，4.5克×10袋/盒 s17 内蒙古九郡药业有限责任公司 221011 水丸，4.5克×10袋/盒 s18 内蒙古九郡药业有限责任公司 221103 水丸，4.5克×8袋/盒 s19 内蒙古九郡药业有限责任公司 221103 水丸，4.5克×8袋/盒 s20 内蒙古九郡药业有限责任公司 221103 水丸，4.5克×8袋/盒 s21 内蒙古九郡药业有限责任公司 221103 水丸，4.5克×8袋/盒 s22 内蒙古九郡药业有限责任公司 221103 水丸，4.5克×8袋/盒 s23 内蒙古九郡药业有限责任公司 221104 水丸，4.5克×8袋/盒 s24 内蒙古九郡药业有限责任公司 221104 水丸，4.5克×8袋/盒 s25 内蒙古九郡药业有限责任公司 221104 水丸，4.5克×8袋/盒 s26 内蒙古九郡药业有限责任公司 221104 水丸，4.5克×8袋/盒 s27 内蒙古九郡药业有限责任公司 221104 水丸，4.5克×8袋/盒 s28 山东广育堂国药有限公司 20220608048 水丸，4.5克×8袋/盒 s29 山东广育堂国药有限公司 20220608048 水丸，4.5克×8袋/盒 s30 山东广育堂国药有限公司 20220608048 水丸，4.5克×8袋/盒 s31 山东广育堂国药有限公司 20220608089 水丸，4.5克×8袋/盒 s32 山东广育堂国药有限公司 20220705156 水丸，4.5克×8袋/盒 s33 山东广育堂国药有限公司 20220705198 水丸，4.5克×8袋/盒 s34 山东广育堂国药有限公司 20220705252 水丸，4.5克×8袋/盒 s35 山东广育堂国药有限公司 20220706107 水丸，4.5克×8袋/盒 s36 山东广育堂国药有限公司 20220706145 水丸，4.5克×8袋/盒 s37 山东广育堂国药有限公司 20220706179 水丸，4.5克×8袋/盒 s38 山东广育堂国药有限公司 20220706179 水丸，4.5克×8袋/盒 s39 山东广育堂国药有限公司 20220706189 水丸，4.5克×8袋/盒 s40 山东广育堂国药有限公司 20220706240 水丸，4.5克×8袋/盒

19、2 方法与结果

20、2.1 色谱条件

21、采用2.1mm×100mm，1.8μm的waters acquity uplc hss t3色谱柱，柱温38℃，以乙腈为流动相a，以体积分数0.2%的甲酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱，流速为0.4ml/min，检测波长为245,276,284,292,315,325nm，进样量为3μl。

22、按下表进行梯度洗脱：

23、 时间（min） 流动相a（%） 流动相b（%） 0 4 96 2 5 95 4 10 90 7 12 88 14 19 81 17 23 77 22 30 70 34 36 64 45 44 56 55 57 43 62 75 25 65 90 10 70 90 10

24、2.2 对照品溶液的制备

25、称精密称取对照品甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素及和厚朴酚溶解于甲醇中，得到一定浓度的对照品储备液；分别精密量取一定量所述对照品储备液加溶剂稀释，得混合对照品溶液；

26、2.3 供试品溶液的制备

27、取舒肝平胃丸，研细，取4.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇40ml，加热回流1小时，抽滤，精密加入甲醇20ml，加热回流30分钟，抽滤，两次滤液合并定容到50ml容量瓶，滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液。

28、2.4 方法学研究

29、2.4.1 线性关系考察

30、分别精密称取甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、和厚朴酚对照品1.9mg、3.0mg、3.0mg、1.9mg、3.0mg、3.0mg、1.9mg、3.0mg置10ml容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作罗布麻叶药材线性母液。将母液分别稀释5个不同倍数获得系列浓度的混合对照品溶液。

31、精密吸取混合上述混合对照品溶液3μl，按上述色谱条件测定，记录色谱图，以各组分峰面积（y）和对照品浓度（x）进行回归处理，得各组分回归方程及线性范围，结果见表2。

32、表2 舒肝平胃丸中8个成分的线性关系考察结果

33、 化合物 回归方程 r2 线性范围（μg/ml） 甘草苷 15,586,024.7764 x + 511.0592 0.9997 0.76～7.6 柚皮苷 12,942,988.2415 x + 12,751.8496 0.9997 24～240 橙皮苷 12,461,927.8467 x + 56,078.3774 0.9997 28.8～288 新橙皮苷 15,266,502.0440 x + 16,451.7510 0.9997 22.8～288 异甘草苷 32,496,181.0585 x + 1,491.1845 0.9997 0.27～2.72 甘草素 26,479,885.5949 x + 1,213.7406 0.9997 1.4～14 异甘草素 59,469,656.3166 x + 467.2416 0.9997 0.27～2.72 和厚朴酚 12,180,829.1404 x + 754.4715 0.9996 0.35～3.48

34、2.4.2 精密度试验

35、取同一混合对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，计算各待测组分的峰面积rsd值，结果甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、和厚朴酚8个待测成分峰面积的rsd分别为0.81%、0.84%、0.97%、0.83%、0.44%、0.38%、0.38%、0.64%，表明仪器精密度良好。

36、2.4.3 稳定性试验

37、取同一供试品溶液（s25），室温下放置，分别在0、2、4、6、8、12h进样分析，记录色谱图，计算各待测成分峰面积的rsd值，结果甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、和厚朴酚8个待测成分峰面积的rsd分别为0.80%、0.09%、0.07%、0.08%、0.53%、1.19%、1.49%、0.26%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

38、2.4.4 重复性试验。

39、取同一批次的舒肝平胃丸（s4），共6份，每份4.0g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，取1μl进样分析，记录色谱图，分别计算各待测成分色谱峰面积的rsd值，结果甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、和厚朴酚峰面积的rsd分别为1.61%、1.53%、1.13%、1.90%、0.45%、1.64%、1.02%、0.64%，表明方法重复性良好。

40、2.5 样品含量测定

41、取40批舒肝平胃丸样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按既定的方法和条件进样分析，记录色谱图，根据“2.4.1”项下回归方程分别计算40批样品中8种待测成分的含量，结果见表3。

42、表3 40批舒肝平胃丸含量测定结果

43、 批次 甘草苷(mg/g) 柚皮苷(mg/g) 橙皮苷(mg/g) 新橙皮苷(mg/g) 异甘草苷(mg/g) 甘草素(mg/g) 异甘草素(mg/g) 和厚朴酚(mg/g) s1 0.51 4.44 6.74 3.87 0.01 0.16 0.05 0.89 s2 0.42 4.01 5.63 3.54 0.01 0.10 0.04 0.76 s3 0.45 4.24 6.01 3.79 0.01 0.11 0.04 0.82 s4 0.34 4.34 7.30 3.73 0.01 0.22 0.08 0.91 s5 0.35 4.42 7.39 3.78 0.01 0.23 0.09 0.92 s6 0.35 4.35 7.33 3.85 0.01 0.22 0.08 0.92 s7 0.35 4.47 7.43 3.85 0.01 0.23 0.09 0.92 s8 0.31 4.32 7.23 3.70 0.01 0.22 0.08 0.90 s9 0.29 4.33 7.05 3.61 0.00 0.22 0.08 0.90 s10 0.50 3.81 4.35 3.39 0.01 0.04 0.02 0.57 s11 0.58 4.29 4.54 3.53 0.01 0.04 0.02 0.43 s12 0.56 4.26 4.42 3.44 0.01 0.04 0.02 0.41 s13 0.52 4.29 5.93 3.68 0.01 0.03 0.02 0.37 s14 0.49 4.13 5.72 3.53 0.01 0.03 0.02 0.36 s15 0.48 4.04 5.56 3.49 0.01 0.03 0.02 0.34 s16 0.53 4.37 6.07 3.84 0.01 0.03 0.02 0.39 s17 0.52 4.20 5.59 3.69 0.01 0.03 0.02 0.62 s18 0.51 4.42 5.37 3.86 0.01 0.14 0.05 0.78 s19 0.50 4.29 5.20 3.74 0.01 0.14 0.04 0.76 s20 0.51 4.39 5.36 3.84 0.01 0.14 0.05 0.76 s21 0.53 4.32 5.59 3.79 0.01 0.06 0.03 0.67 s22 0.51 4.28 5.48 3.76 0.01 0.08 0.03 0.69 s23 0.47 4.43 6.13 3.86 0.01 0.13 0.04 0.72 s24 0.48 4.02 5.47 3.54 0.01 0.11 0.04 0.41 s25 0.43 4.24 5.84 3.67 0.01 0.13 0.04 0.70 s26 0.47 4.47 6.20 3.92 0.01 0.14 0.05 0.72 s27 0.46 4.34 5.94 3.80 0.01 0.13 0.05 0.72 s28 0.38 4.42 5.72 3.39 0.01 0.03 0.03 0.64 s29 0.36 4.12 5.42 3.16 0.01 0.03 0.03 0.61 s30 0.37 4.26 5.57 3.25 0.01 0.03 0.03 0.62 s31 0.36 4.17 5.36 3.16 0.01 0.02 0.03 0.62 s32 0.47 5.13 7.19 4.02 0.01 0.03 0.02 1.08 s33 0.46 5.11 7.28 3.97 0.01 0.02 0.02 1.11 s34 0.43 4.75 6.57 3.73 0.01 0.02 0.02 0.98 s35 0.39 4.34 6.08 3.36 0.01 0.02 0.02 0.92 s36 0.35 3.85 5.35 2.99 0.02 0.02 0.02 0.78 s37 0.31 3.39 4.77 2.62 0.00 0.02 0.02 0.71 s38 0.30 3.35 4.69 2.61 0.01 0.02 0.02 0.69 s39 0.46 5.07 6.98 3.98 0.01 0.02 0.02 1.04 s40 0.37 4.03 5.67 3.15 0.02 0.02 0.02 0.84

44、3 结论

45、本实验所建立的超高效液相色谱法（uplc）同时测定舒肝平胃丸中8种成分的定量分析方法简单、快捷、准确、稳定性好，可为舒肝平胃丸的质量控制提供参考。