用于制备靶向偶联物的亲水性四嗪官能化的负载物的制作方法

本发明涉及官能实体(负载物)与靶向剂的生物偶联领域，其中一个或多个负载物分子与靶向剂，例如单克隆抗体偶联，其中靶向剂特别是生物靶向剂，例如抗体药物偶联物(adc)。更特别地，本发明涉及新型亲水性四嗪分子及其制备，所述四嗪允许负载物分子与靶向剂如单克隆抗体更有效地偶联。本发明还涉及用于制备相应官能化的负载物分子的特定四嗪中间体。本发明还涉及各种的偶联物(特别是生物偶联物)及其制备方法。本发明还涉及本发明的这些偶联物在医学中的用途、相应的药物组合物以及相应的诊断和分析试剂盒。

背景技术：

1、adc是一个备受关注的快速增长的肿瘤治疗类别，这反映在数量日益增长的获批准的adc药物和越来越多的临床试验中。

2、各负载物与单克隆抗体(mab)的所需偶联通常通过随机连接来完成。这通常导致现有adc种类的非均质性，并且药物与抗体的比率(dar)从完全未修饰的单克隆抗体到不利的大量连接的细胞毒性分子不等，这导致批次间差异的问题，并可能导致聚集和伴随的副作用，如快速清除、免疫原性或肝毒性。

3、克服这些限制的解决方案是通过位点特异性偶联方法生产均质adc/放射免疫偶联物(ric)。位点特异性连接方法为严格控制dar、药物代谢动力学特性和生产均匀批次的给药药物提供了可能性。这也导致治疗指数的改善，因为消除了不希望的adc种类的副作用。

4、每个adc的另一个重要组成部分是用于连接负载物的接头。

5、通常，不可裂解的接头(仅在经蛋白酶体降解后释放载荷)和可裂解的接头(通过酶促、还原或酸性裂解释放母体药物)之间存在差异。此外，接头化学也影响实际释放的活性代谢物的性质。例如，亲水性的增加导致跨膜扩散速率的降低和细胞内滞留的增加，以及对癌细胞多药耐药机制的敏感性降低。

6、发明人已经报道了将用于点击反应的应变环辛烯-赖氨酸衍生物基因编码到蛋白中(t.plass,s.milles,c.koehler,c.schultz,e.a.lemke,angew.chem.int.ed.2011,50,3878-81)，并报道了可以与1,2,4,5-四嗪进行(应变促进)逆电子需求diels-alder环加成(iedda)的ncaa的合成和基因编码(t.plass,s.milles,c.koehler,j.szymański,r.mueller,et al.,angew.chem.int.ed.2012,51,4166-70；i.t.plass,o.schraidt,j.szymański,j.a.g.briggs,et al.,angew.chem.int.ed.2014,53,2245-9；e.kozma,i.b.r.varga,i.v.aramburu,j.h.kang,et al.,chembiochem 2016,17,1518-24；j.-e.hoffmann,t.plass,i.i.v.aramburu,c.koehler,et al.,chem.eur.j.2015,21,12266-70)。该gce技术的扩展导致将这样的ncaa位点特异性地引入昆虫细胞产生的非糖基化免疫球蛋白中，并随后通过上述点击化学进行修饰(c.koehler,p.f.sauter,m.wawryszyn,g.e.girona,k.gupta,et al.,nat.methods 2016,13,997-1000.)。

7、mao等人在angew.chem int ed(2019),58,1106中描述通过含巯基促进剂进行不对称1,2,4,5-四嗪的有机催化和可放大的合成。特别地，通过应用3-巯基丙酸作为催化剂，在乙醇溶液中使2种不同的腈离析物与水合肼反应，然后用亚硝酸钠氧化，合成了一系列不对称取代的1,2,4,5-四嗪衍生物。一种特定的化合物是1,2,4,5-四嗪衍生物，其1位被甲基膦酸酯基团取代，6位被甲基取代。该膦酸酯前体通过horner-wadsworth-emmons反应进一步衍生化以引入含有不同反式烯烃部分的侧链。

8、us2019247513a1公开了四嗪化合物和能够与所述四嗪进行逆电子需求dielsalder反应的亲双烯体，以及它们在生物正交药物活化中的用途。特别地，化合物333和14.5至14.7涉及负载荧光负载物的四嗪衍生物，其通过各种化学性质的间隔子与四嗪核心间隔开，如基于芳基或肽基或烷基的间隔子以及基于聚氧烷基的亲水基团。

9、wo2020256544a1涉及以高点击偶联产率为特征的取代四嗪(tetrazine)。tartrazine核心连接到基于吡啶基的间隔子上，其本身通过戊二酰基(glutarly)连接到负载物r87(如细胞毒性药物)和/或聚氧烷基亲水基团上。

10、mao等人(angew.chem int ed(2021),60 2393-2397)以及wo2020239039a1公开了四嗪化合物，其中能够形成化学键的亲水或化学部分(例如羧基、羟基或基于磷酸酯的基团)被基于烷基的间隔子与四嗪核心隔开。在这方面，mao等人还描述了化合物，其中所述能够形成化学键的亲水或化学部分被荧光基团替代。

11、shainyan,b.a等人(chemical abstracts service,columbus,ohio,us；database accession no.1983:453711)涉及具有烷基砜基团作为对位取代基的四嗪。

12、wo2014081301a1公开了四嗪，其中四嗪核心通过基于芳基的间隔子连接到能够形成化学键的各种亲水或化学部分。

13、oller-salvia等人(angew.chem int ed(2018),57 2831-2834)涉及抗体药物偶联物领域，并公开了一种构建体，其中曲妥珠单抗通过逆电子需求diels–alder环加成而位点选择性地偶联至四嗪修饰的单甲基奥利斯他汀e(mmae)。用于所述位点特异性偶联的四嗪柄由连接至四嗪核心的芳基部分组成。

14、handula等人(molecules 2021,26,4640)涉及在预靶向策略中使用生物正交反应，例如iedda反应。其公开了各种四嗪替代物作为合适的双烯，这些双烯的特征在于存在具有烷基和/或芳基间隔子的对位取代的四嗪核心。该公开的图2涉及基于各自的反应性对所述四嗪替代物的分类。

15、需要进一步改进1,2,4,5-四嗪衍生物，其允许1,2,4,5-四嗪官能化的负载物分子通过生物正交反应更有利地偶联到相应官能化的靶向分子上。特别地，需要进一步改进1,2,4,5-四嗪衍生物，其允许上述生物正交反应通过应变促进的逆电子需求diels–alder环加成(spiedac)进行，而在任选缓冲的水环境中没有更大的空间位阻。更特别地，需要这样的四嗪衍生物，由于其增加的亲水性，其允许更多疏水负载物的偶联，并且在药理活性偶联物的情况下，这样的偶联物在体内提供更好的功能特征。

技术实现思路

1、上述问题令人惊讶地通过提供1,2,4,5-四嗪官能化的负载物分子而得到解决，所述官能化的负载物分子携带作为四嗪c取代基的小亲水基团(例如膦酸酯残基)。本发明能够在水性缓冲液中通过spiedac容易地使用负载物进行生物正交生物偶联，而不需要可能破坏性的添加有机溶剂，因此可以使用敏感的生物试剂。这也有助于防止聚集并提高所形成的生物偶联剂的溶解度。由于其相对较小的尺寸，与较大的增溶单元(如peg、糖苷等)相比，它不应表现出太多的空间位阻，并且允许连接最小尺寸的负载物。例如，偶联物中不一定需要大体积的peg接头，这反过来又允许减小最终负载物或相应靶向偶联物的大小。在相同条件下，基于相应甲基四嗪基团的更小的负载物不能与抗体偶联。还观察到，以要求保护的方式增加亲水性允许提供与改善的药物动力学相关联的偶联物，特别是adc，同时四嗪的亲水基团的较小尺寸使整个负载物被抗体更好地遮盖。

2、更特别地，通过提供携带膦酸酯基团的四嗪衍生物解决了上述问题，所述衍生物进一步携带允许与负载物分子偶联的化学部分，例如通过酰胺偶联或形成氨基甲酸酯。相应的四嗪官能化的负载物分子如下文所述的通式i所示；相应的四嗪官能化的中间体如下文所述的通式ii所示。