一种脑血管平滑肌细胞分泌的外泌体的制备方法以及由此得到的外泌体及其应用

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种脑血管平滑肌细胞分泌的分泌物质的制备方法以及由此得到的外泌体及其应用。

背景技术：

1、脑卒中(stroke)是一种急性脑血管疾病，又被称为“卒中”或“脑血管意外”。缺血性中风是最常见的中风类型。其中围产儿脑卒中发生于婴儿出生及以后28天内，对于围产儿脑卒中，目前缺乏有效的治疗手段，而且发生脑卒中对于患儿的影响长期且经济负担高。

2、在1981年，利用电子显微镜检测到细胞外囊泡的平均直径500nm至1000nm，随后首次将这些颗粒称为外泌体。接下来，外泌体的形态以及功能的相关研究得到快速发展。外泌体产生于细胞内溶酶体相关的途径，随后通过细胞质膜向外出芽的方式释放。外泌体通过与细胞膜直接融合、内吞作用和配体-受体相互作用这三种方式被摄取。外泌体是细胞间通讯的关键介质，参与正常生理过程并发挥重要作用。且外泌体具有天然的大脑归巢能力，使其适用于治疗脑部疾病。

3、值得注意的是，外泌体已在中风中得到广泛研究。最新的研究表明间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)分泌的外泌体被认为是mscs促进中风后神经血管重塑和神经功能恢复的主要机制。除了msc来源的外泌体外，来自其他细胞类型的外泌体也在卒中后起神经保护和恢复神经功能作用。例如血小板来源的外泌体剂量依赖性地增加内源性神经干细胞增殖、神经发生，以及中风核心区的脑血管生成，显著改善大鼠缺血性中风后的神经功能。且已有研究表明外周平滑肌细胞分泌的外泌体作为胞外信号来调节周围细胞功能。目前，中风的研究主要集中在神经血管单位(neurovascular unit，nvu)。但目前尚无从脑血管平滑肌细胞获取分泌的外泌体的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供脑血管平滑肌细胞分泌的细胞分泌物质组合物的制备方法。

2、本发明的另一个目的是提供由上述脑血管平滑肌细胞分泌的组合物的制备方法得到的细胞分泌物质组合物。

3、本发明的又一个目的是提供脑血管平滑肌细胞分泌的外泌体的制备方法。

4、本发明的还一个目的是提供由上述脑血管平滑肌细胞分泌的外泌体的制备方法得到的外泌体。

5、本发明的再一个目的是提供上述组合物和外泌体的应用。

6、一方面，本发明提供了一种细胞分泌物质组合物的制备方法，其特征在于，包括对脑血管平滑肌细胞进行培养，收集条件培养基以获得细胞分泌物质组合物。

7、在一些实施方式中，所述细胞分泌物质组合物的制备方法包括以下步骤：

8、s1，使用平滑肌细胞培养基培养脑血管平滑肌细胞，待细胞生长至融合度为至少90％时，将平滑肌细胞培养基替换为适合神经元生长的培养基，并继续培养1-8天，例如1、2、3、4、5、6、7或8天，优选2-6天；

9、s2，收集条件培养基，即得细胞分泌物质组合物。

10、在一些实施方式中，s1中，平滑肌细胞培养基可以是指适于平滑肌生长的培养基，其实例包括但不限于smcm、dmem+10％ fbs以及neurobasal a。

11、在本文中，smcm指的是smooth muscle cell medium，dmem指的是dulbecco'smodified eagle medium，fbs指的是胎牛血清(fetal bovine serum)，fbs的用量10％是基于dmem和fbs总体积的体积百分数，neurobasal a指的是neurobasaltm-a培养基。在一些实施方式中，s1中，适合神经元生长的培养基可以是指神经基础培养基，其适于新生和成体脑神经元的长期维持和成熟，实例包括但不限于neurobasal a和dmem+10％fbs。

12、在一些实施方式中，s1中，所述脑血管平滑肌细胞为脑血管平滑肌细胞。

13、在一些实施方式中，s1中，培养条件为37℃，5％co2。

14、在一些实施方式中，s2中，如果为了清除细胞碎片等精细操作，也可进一步包括将收集的条件培养基进行过滤(例如millipore的0.22mm滤膜)的步骤。

15、另一方面，本发明提供了由上述细胞分泌物质的制备方法制备的细胞分泌物质组合物。

16、再一方面，本发明提供了上述细胞分泌物质的应用，所述应用包括：在制备用于保护神经元的药物中的应用；在制备用于防止应激引起的神经元死亡(例如微环境的改变引起的应激以及缺血缺氧的情况下保护神经元)的药物中的应用；在制备用于预防和/或治疗脑卒中(特别是，围产儿脑卒中)的药物中的应用。

17、又一方面，本发明提供了一种外泌体的制备方法，其特征在于，包括：对脑血管平滑肌细胞进行培养，收集条件培养基并富集外泌体以获得外泌体。

18、在一些实施方式中，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：

19、s1，使用平滑肌细胞培养基培养脑血管平滑肌细胞，待细胞生长至融合度为至少90％时，将平滑肌细胞培养基替换为适合神经元生长的培养基，并继续培养1-8天，例如1、2、3、4、5、6、7或8天优选2-6天；

20、s2，收集条件培养基，富集外泌体。

21、在一些实施方式中，s1中，平滑肌细胞培养基可以是指适于平滑肌生长的培养基，其实例包括但不限于smooth muscle cell medium(smcm)、dmem+10％ fbs以及neurobasala。

22、在一些实施方式中，s1中，适合神经元生长的培养基可以是指神经基础培养基，其适于新生和成体脑神经元的长期维持和成熟，实例包括但不限于neurobasal a和dmem+10％ fbs。

23、在一些实施方式中，s1中，所述脑血管平滑肌细胞为脑血管平滑肌细胞。

24、在一些实施方式中，s1中，培养条件为37℃，5％co2。

25、在一些实施方式中，s2中，所述富集包括以下步骤：

26、任选地，s2-1，将收集的条件培养基在200g-600g，优选300g条件下离心5-15分钟，其中优选离心10分钟，然后吸取上清液；

27、任选地，s2-2，将s2-1中得到的上清液在1200g-4000g，优选2000g条件下离心10-30分钟，其中优选离心20分钟，吸取上清液；

28、s2-3，将收集到的条件培养基或者s2-1中得到的上清液或者s2-2中得到的上清液直接在10000g-12000g，优选10000g条件下离心10-60分钟，其中优选离心30分钟，吸取上清液；

29、任选地，s2-4，将s2-3中得到的上清液使用过滤膜(例如millipore的0.22mm滤膜)过滤，紧接着使用超滤系统(例如millipore的500kd的超滤系统)进行浓缩得到浓缩液，从而可以得到纯度更高的外泌体；

30、s2-5，将s2-3中得到的上清液或者s2-4中得到的浓缩液在100000g-130000g，优选100000g条件下离心60-120分钟，其中优选90分钟离心之后(例如，用pbs)重悬沉淀，再次在100000g-130000g，优选100000g条件下离心60-120分钟，其中优选90分钟离心之后收集的沉淀为外泌体。

31、还一方面，本发明提供了由上述外泌体的制备方法得到的外泌体。

32、再一方面，本发明提供了上述外泌体的应用，所述应用包括：在制备用于保护神经元的药物中的应用；在制备用于防止应激(例如微环境的改变引起的应激)引起的神经元死亡以及缺血缺氧的情况下保护神经元的药物中的应用；在制备用于预防和/或治疗脑卒中(特别是，围产儿脑卒中)的药物中的应用。

33、本发明中，术语“条件培养基”指的是将培养过脑血管平滑肌细胞的培养基除细胞取其上清液得到的溶液。

34、本发明中，所述脑血管平滑肌细胞可以是市售的脑血管平滑肌细胞。在一些实施方式中，所述脑血管平滑肌细胞可以是小鼠脑血管平滑肌细胞。在一些实施方式中，所述小鼠脑血管平滑肌细胞可以由小鼠分离得到。

35、本发明基于在发展中国家，脑卒中是最为常见的造成成年人死亡的因素之一，并且围产儿中风目前没有有效的干预和治疗手段，因此亟待开发新的神经保护方案。本发明方法能够从脑血管平滑肌细胞收获外泌体。外泌体作为生理和病理生理条件(如中风)中细胞间通讯载体的功能，从脑血管平滑肌细胞收获的外泌体为中风的安全有效治疗方法提供了范式转变和巨大潜力。因此，脑血管平滑肌分泌的外泌体可潜在地用于改善中风后机体功能，对于后续的临床应用具有重大意义。

36、本发明的脑血管平滑肌细胞分泌的外泌体潜在的治疗卒中的优势在于：

37、1)低免疫性；

38、2)天然的大脑归巢能力且转运至供体细胞的效率高；

39、3)循环稳定性高；

40、4)无血管阻塞作用，并降低继发性微血管血栓形成的风险；

41、5)开发大规模工程化治疗囊泡细胞工厂的潜力。