细胞外囊泡的分离纯化方法与流程

本公开涉及用于分离纯化细胞外囊泡的分离纯化方法。

背景技术：

1、作为从培养液分离纯化有用物质的方法，已知有使用分离膜的方法。

2、日本特开平3-39084号公报中记载了一种单细胞藻类培养液的浓缩方法的发明，其中，通过使用截留分子量10000～1000000的中空纤维型超滤膜(uf膜)组件对单细胞藻类的培养液进行错流过滤而进行浓缩时，进行定期的伏流清洗。

3、通过错流过滤将培养液浓缩时，在uf膜的外侧存在浓缩液，透过液进入uf膜的内侧。进行伏流清洗时，清洗水在进入uf膜的内侧之后从uf膜的外侧出来，从而清洗uf膜。

4、日本特开2018-76291号公报中记载了一种回收有用物质的方法的发明，该方法包括：从细胞的培养槽排出培养液，将与排出的培养液等量的新鲜培养基加入上述培养槽的渗出工序；和使用实质上不具有致密层的多孔膜将从上述培养槽提取出的培养液进行过滤的过滤工序，上述过滤工序中的过滤为切向流过滤(tangential flow filtration)，上述过滤工序中的透过液的速度为1.0lmh以下。

5、其中记载了上述有用物质选自蛋白质、病毒、外泌体及核酸。作为上述切向流过滤，记载了也可以实施交替切向流过滤。细胞外囊泡是指被释放至细胞外的由脂质双层包覆的没有核的粒子的总称，包括核酸、蛋白质、脂质、各种代谢产物等，外泌体、微泡(microvesicle)及凋亡囊泡等属于细胞外囊泡。

6、在cytometry research 26(1):1～6,2016,“基于exosome的液体活检新进展”(吉冈祐亮、落谷孝广)中，作为外泌体的新检测法，记载了exoscreen法。

技术实现思路

1、本公开的课题在于提供用于分离纯化细胞外囊泡的分离纯化方法。

2、本公开提供一种细胞外囊泡的分离纯化方法，其是从包含细胞外囊泡和不需要物质的溶液分离纯化上述细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，

3、上述分离纯化方法是通过使上述包含细胞外囊泡和不需要物质的溶液的培养上清液与吸附剂接触而使除上述细胞外囊泡以外的不需要物质吸附保持于上述吸附剂的吸附剂处理方法，

4、上述吸附剂是细孔内部带正电的多孔粒状物，能够将除上述细胞外囊泡以外的带负电的不需要物质吸附保持于上述细孔内部。

5、根据本公开的一个实施方式，上述包含细胞外囊泡和不需要物质的溶液可以为包含细胞外囊泡的培养上清液。

6、根据本公开的一个实施方式，上述包含细胞外囊泡和不需要物质的溶液可以为包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液。

7、根据本公开的一个实施方式，上述吸附剂处理方法可以选自下述中的方法：使上述包含细胞外囊泡和不需要物质的溶液通过填充有上述吸附剂的柱的方法、在装有上述包含细胞外囊泡和不需要物质的溶液的容器内加入上述吸附剂后进行搅拌混合的方法。

8、根据本公开的一个实施方式，可以使用具有不同的吸附性能的多种吸附剂作为上述吸附剂，实施基于上述多种吸附剂的多次吸附剂处理的方法。

9、根据本公开的一个实施方式，上述具有不同的吸附性能的多种吸附剂可以为选自以下的一种或多种：多孔粒状物的细孔直径不同的吸附剂、多孔粒状物的比表面积不同的吸附剂、多孔粒状物的平均粒径不同的吸附剂、构成多孔粒状物的基材的种类不同的吸附剂、存在于多孔粒状物的细孔内部表面的官能团的种类、密度不同的吸附剂。

10、另外，本公开提供一种细胞外囊泡的分离纯化方法，其是从包含细胞外囊泡和不需要物质的溶液分离纯化上述细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，

11、上述分离纯化方法是将上述的吸附剂处理方法和膜分离方法组合的方法。

12、上述分离纯化方法可以是将上述吸附剂处理方法和基于上述膜分离方法的处理交替实施的方法、或是随机实施的方法，另外，最初的处理可以为上述吸附剂处理方法。

13、根据本公开的一个实施方式，上述膜分离方法可以是使用中空纤维膜进行过滤的膜分离方法。

14、根据本公开的一个实施方式，上述膜分离方法可以是使用中空纤维膜进行过滤的膜分离方法，

15、上述膜分离方法中使用的中空纤维膜可以是内径为0.2mm～1.4mm、截留分子量为10万～100万的中空纤维膜，

16、上述膜分离方法中的过滤方法可以为一个方向或交替方向的切向流过滤。

17、根据本公开的一个实施方式，上述膜分离方法可以是使用中空纤维膜进行过滤的膜分离方法，

18、上述膜分离方法中使用的中空纤维膜可以是内径为0.2mm～1.4mm、截留分子量为10万～100万的中空纤维膜，

19、上述膜分离方法中的过滤方法具有：

20、第1过滤工序，将通过上述吸附剂处理方法得到的处理液从上述中空纤维膜的一端侧的第1开口部压入并进行过滤，分离成透过液和第1浓缩液；以及

21、第2过滤工序，将上述第1浓缩液从上述中空纤维膜的另一端侧的第2开口部压入并进行过滤，分离成透过液和第2浓缩液，

22、上述过滤方法可以是交替实施多次上述第1过滤工序和上述第2过滤工序的、通过一个方向或交替方向的切向流过滤而得到上述细胞外囊泡的浓度提高了的浓缩液的方法，

23、上述第1过滤工序和上述第2过滤工序中的膜面速度可以为0.3m/sec～2m/sec。

24、根据本公开的一个实施方式，上述膜分离方法中的过滤方法可以是利用孔径0.1μm～0.5μm的精密过滤膜将通过上述吸附剂处理方法得到的处理液进行过滤后，使用上述精密过滤膜的过滤液交替实施多次上述第1过滤工序和上述第2过滤工序的工序。

25、根据本公开的一个实施方式，可以实施上述第1过滤工序，可以在相对于通过上述吸附剂处理方法得到的处理液或通过上述第2过滤工序得到的第2浓缩液加入缓冲液而进行了稀释之后，实施上述第1过滤工序。

26、根据本公开的一个实施方式，上述第1过滤工序和上述第2过滤工序可以是通过导入选自氮气、不活泼气体、二氧化碳、用hepa过滤器进行了过滤后的空气中的气体进行压入而实施的。

27、根据本公开的一个实施方式，可以将作为起始原料的上述包含细胞外囊泡和不需要物质的溶液中包含的蛋白质量减少至1/5以下的量。

28、根据本公开的一个实施方式，以上述包含细胞外囊泡和不需要物质的溶液中包含的细胞外囊泡的量作为基准时，上述浓缩液中包含的细胞外囊泡的使用exoscreen法测定的量可以是浓缩倍率为5倍以上且回收率为50％以上。

29、根据本公开的一个实施方式，上述中空纤维膜可以是在具有多个液体出入口的壳体内容纳有多根中空纤维膜的中空纤维膜组件。

30、根据本公开的一个实施方式，在交替实施上述第1过滤工序和上述第2过滤工序时，可以使第1过滤工序的过滤对象的稀释倍数随着上述实施次数增加而增加。

31、根据本公开的一个实施方式，在交替实施上述第1过滤工序和上述第2过滤工序时，可以使第1过滤工序的过滤对象的稀释倍数随着上述实施次数增加而以2容量倍～15容量倍的范围增加。

32、根据本公开的细胞外囊泡的分离纯化方法，可以将细胞外囊泡浓缩至高浓度。