具有优化的ITAM结构域及CD28与4-1BB双共刺激分子的双靶点CAR-T

本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及具有优化的cd3ζ免疫受体酪氨酸激活结构域(itam)结构域及双共刺激分子的双靶点car-t细胞。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞(car-t)免疫治疗是通过基因工程技术使t淋巴细胞表达特异性抗体的结合位点，使其不依赖主要组织相容性复合体递呈来识别肿瘤相关抗原，从而杀伤肿瘤细胞。目前特异性靶向cd19的car-t细胞疗法，在血液肿瘤中已取得了良好的治疗效果。然而仍有14％-66％的患者会出现复发，导致复发的原因有两种，在cd19阳性复发的病人中主要是由于car-t细胞的活性不够强或者是在体内不能持久存在，而在cd19阴性复发的病人(占复发病人的30％-95％)中，主要是由于抗原丢失导致的肿瘤细胞免疫逃逸。

2、在car分子结构中，共刺激分子对car-t细胞的活化强度具有重要的作用。激活信号强度不足则无法产生令人满意的杀伤效果，而过强的激活信号会有损car-t的持久性。已有报道通过构建携带cd28和4-1bb双共刺激分子并共享cd3ζ的双靶点car-t以提高改善car-t细胞的活性及持久性。cd3z中itam结构域活化的数量及位置也被证明对car激活的信号强弱的及持久性有重要的影响，在以cd28为共刺激分子靶向cd19的car-t中，只保留cd3z中第一个itam的磷酸化位点即可获得体内抗肿瘤活性更持久的car-t。

3、目前，本领域仍需要对car分子结构进行进一步优化，构建肿瘤杀伤能力强、活性更持久的双靶点car-免疫细胞。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供保留肿瘤杀伤能力且具有持久活性的双靶点car-免疫细胞。

2、在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)组合，所述组合至少包括特异性靶向不同抗原的第一car和第二car，所述第一car和第二car含有源于cd3ζ的胞浆信号传导序列(cd3ζ区)，

3、其中，所述cd3ζ区包括3个免疫受体酪氨酸激活结构域itam，其从n端到c端具有如下式i所示结构：

4、itam1-itam2-itam3(i)；

5、式中，

6、各“-”独立地为连接肽或肽键；

7、itam1、itam2和itam3分别为免疫受体酪氨酸激活结构域；

8、并且，所述itam1、itam2和itam3中至少1或2个发生失活突变。

9、在另一优选例中，所述的失活突变为，相对于野生型itam结构域，所述的itam结构域中两个酪氨酸(y)突变为苯丙氨酸(f)。

10、在另一优选例中，所述的失活突变包括：

11、(1)itam1相对于seq id no:8所示野生型序列的第12位和23位酪氨酸(y)突变为苯丙氨酸(f)；

12、(2)itam2相对于seq id no:10所示野生型序列的两个酪氨酸(y)突变为苯丙氨酸(f)。

13、(3)itam3相对于seq id no:11所示野生型序列的两个酪氨酸(y)突变为苯丙氨酸(f)。

14、在另一优选例中，所述的第一car和第二car中，至少一个car的itam1发生失活突变。

15、在另一优选例中，所述第一car和第二car的失活突变选自下组：

16、(m1)第一car中，itam2和itam3发生失活突变，第二car中，itam3发生失活突变；

17、(m2)第一car中，itam2和itam3发生失活突变，第二car中，itam1和itam3发生失活突变；

18、(m3)第一car中，itam2和itam3发生失活突变，第二car中，itam1发生失活突变；

19、(m4)第一car中，itam2和itam3发生失活突变，第二car中，itam1和itam2发生失活突变；

20、(m5)第一car中，itam1和itam3发生失活突变，第二car中，itam2和itam3发生失活突变；

21、(m6)第一car中，itam1和itam3发生失活突变，第二car中，itam3发生失活突变；

22、(m7)第一car中，itam1发生失活突变，第二car中，itam2和itam3发生失活突变；

23、(m8)第一car中，itam1发生失活突变，第二car中，itam1和itam3发生失活突变；

24、(m9)第一car中，itam1和itam2发生失活突变，第二car中，itam3发生失活突变；

25、(m10)第一car中，itam2和itam3发生失活突变，第二car中，itam2和itam3发生失活突变；和

26、(m11)第一car中，itam1和itam2发生失活突变，第二car中，itam1和itam2发生失活突变。

27、在另一优选例中，所述的第一car和第二car的突变选自下表，其中f表示发生失活突变：

28、

29、在另一优选例中，所述的第一car和第二car的突变选自下组：

30、(m1)第一car中，itam2和itam3发生失活突变，第二car中，itam3发生失活突变；

31、(m2)第一car中，itam2和itam3发生失活突变，第二car中，itam1和itam3发生失活突变；

32、(m3)第一car中，itam2和itam3发生失活突变，第二car中，itam1发生失活突变；

33、(m4)第一car中，itam2和itam3发生失活突变，第二car中，itam1和itam2发生失活突变；

34、(m5)第一car中，itam1和itam3发生失活突变，第二car中，itam2和itam3发生失活突变；

35、(m6)第一car中，itam1和itam3发生失活突变，第二car中，itam3发生失活突变；

36、(m7)第一car中，itam1发生失活突变，第二car中，itam2和itam3发生失活突变；

37、(m8)第一car中，itam1发生失活突变，第二car中，itam1和itam3发生失活突变；和

38、(m9)第一car中，itam1和itam2发生失活突变，第二car中，itam3发生失活突变。

39、在另一优选例中，所述的第一car和第二car分别特异性结合选自下组的抗原：cd22、cxcr5、b7-h3、psma、gd、pd-l1、psma2、或其组合。

40、在另一优选例中，所述的第一car的特异性结合cd22，和/或所述第二car特异性结合cxcr5。

41、在另一优选例中，所述的第一car的特异性结合b7-h3，和/或所述第二car特异性结合psma。

42、在另一优选例中，所述的第一car的特异性结合gd2，和/或所述第二car特异性结合b7-h3。

43、在另一优选例中，所述的第一car的特异性结合psma，和/或所述第二car特异性结合pd-l1。

44、在另一优选例中，所述的第一car的特异性结合psma，和/或所述第二car特异性结合psma2。

45、在另一优选例中，所述的第一car和第二car各自独立地具有下式ii所示的结构：

46、eb-m-h-tm-c-cd3ζ(ii)

47、式中，

48、各“-”独立地为连接肽或肽键；

49、eb是胞外结合域；

50、m是无或标记蛋白；

51、h是无或铰链区；

52、tm是跨膜结构域；

53、c是无或共刺激信号分子；

54、cd3ζ是源于cd3ζ的胞浆信号传导序列，其中1-2个免疫受体酪氨酸激活结构域(itam)突变失活。

55、在另一优选例中，所述的第一car的胞外结合域为特异性结合cd22的抗原结合片段(scfv)。

56、在另一优选例中，所述的第一car的胞外结合域eb序列如seq id no:1所示。

57、在另一优选例中，所述的第二car的胞外结合域为特异性结合cxcr5的抗原结合片段(scfv)。

58、在另一优选例中，所述的第二car的胞外结合域eb序列如seq id no:2所示。

59、在另一优选例中，所述的标记蛋白m为选自下组的标签蛋白：flag、myc、ha、和v5。

60、在另一优选例中，所述的h是选自下组的蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、或其组合。

61、在另一优选例中，所述的h是cd8来源的铰链区。

62、在另一优选例中，所述的tm是为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3 epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。

63、在另一优选例中，所述的tm是cd8来源的跨膜区。

64、在另一优选例中，所述铰链区和跨膜区的氨基酸序列如seq id no:3所示。

65、在另一优选例中，所述的c是选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2，或其组合。

66、在另一优选例中，所述的c是4-1bb或cd28来源的共刺激信号分子。

67、在另一优选例中，所述的第一car和第二car具有不同来源的共刺激信号分子。

68、在另一优选例中，所述的第一car具有cd28来源的共刺激信号分子，较佳地具有如seq id no:4所示的氨基酸序列。

69、在另一优选例中，所述的第二car具有4-1bb来源的共刺激信号分子，较佳地具有如seq id no:7所示的氨基酸序列。

70、在另一优选例中，所述的第一car和第二car分别表达或以串联形式表达。

71、在另一优选例中，所述的第一car和第二car通过连接肽串联。

72、在另一优选例中，所述的连接肽为t2a、或p2a。

73、在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体组合。

74、在另一优选例中，所述的核酸分子包括第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒和第二表达盒分别独立地表达第一car和第二car；或者

75、所述的核酸分子表达串联形式的第一car和第二car。

76、在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子。

77、在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

78、在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

79、在另一优选例中，所述载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件wpre、长末端重复序列ltr等。

80、在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子或表达如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体组合。

81、在本发明的第五方面，提供了一种工程化免疫细胞，所述的免疫细胞含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子或表达如本发明第一方面所述的car。

82、在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞选自下组：t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、或其组合。

83、在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞是嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)或嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)。

84、在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞是car-t细胞。

85、在本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：将如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第三方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

86、在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

87、在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如本发明第一方面所述的car、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

88、在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

89、在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

90、在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。

91、在本发明的第八方面，提供了一种如本发明第一方面所述的car、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗疾病的药物或制剂。

92、在另一优选例中，所述的疾病选自下组：cd22相关疾病、cxcr5相关疾病、或其组合。

93、在另一优选例中，所述的疾病包括肿瘤。

94、在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：实体瘤、血液瘤、或其组合。

95、在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。

96、在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、或其组合。

97、在另一优选例中，所述的肿瘤为乳腺癌、或b淋巴细胞瘤。

98、在本发明的第九方面，提供了一种如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

99、在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用有效量的如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第七方面所述的药物组合物。

100、在另一优选例中，所述的疾病选自下组：cd22相关疾病、cxcr5相关疾病、或其组合。

101、在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

102、在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的car免疫细胞是来源于所述对象的细胞(自体细胞)。

103、在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的car免疫细胞是来源于健康个体的细胞(异体细胞)。

104、在另一优选例中，所述的方法可与其他治疗方法联合使用。

105、在另一优选例中，所述的其他治疗方法包括化疗、放疗、靶向治疗等方法。

106、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。