用于检测合成卡西酮MDPV的夹心型电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用

本发明属于电化学发光检测领域，具体涉及一种用于检测合成卡西酮mdpv的夹心型电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、合成卡西酮mdpv是新精神活性物质的一种，其化学结构和药用性质与苯丙胺类兴奋剂相似。这些药物不仅会让使用者产生欣快感，还会对人体系统产生有害影响，甚至会导致死亡，危及人类健康和生命安全。它作用于人的身体和大脑，短期内会使人心跳加快，暴躁易怒甚至产生幻觉。长期的服用会使人肌肉无力甚至出现肾脏和心脏方面的问题。目前，mdpv的检测方法主要有液相色谱法(lc)、气相色谱/质谱法(gc-ms)、液相色谱/质谱法(lc-ms)、荧光光谱(fl)和拉曼光谱(lrs)等等，这些方法的准确度较高，但它们往往需要与红外(ft-ir)和核磁共振(nmr)等方法联用，而且存在价格昂贵，检测限高等一系列问题，这些问题都将限制它们在实际检测中的应用，因此寻找简便快速灵敏的检测手法迫在眉睫。鉴于合成卡西酮能够产生欣快和致幻作用，因此检测电子烟中的合成卡西酮是十分有必要的。

2、电化学发光(ecl)是结合了化学发光和电化学的优势而发展起来的一种方法，因其独特的优势而被广泛应用于生物分析以及药物分析等领域。它具有灵敏度高、背景低、易控制和检测时间短等优点，并且无需引入外部光源，相比于光致发光方法可有效地避免背景光源的干扰，通过高信噪比来提升检测灵敏度，从而达到对目标物进行痕量检测的目的。电化学发光适配体传感器是通过将适配体作为识别模块与ecl技术相结合而创建，极大地提高了靶标分析的灵敏度和特异性。共反应促进剂是提高发光团/共反应体系ecl效率的另一个重要因素，它可以与共反应物相互作用，加快阴极过程中自由基中间体的形成速度，从而提高发光团和共反应物之间的整体效率而被广泛用于ecl信号放大策略。目前，使用电化学发光法检测合成卡西酮mdpv的报道还很少，只有曹等人利用sn-tcpp的双ecl信号特点成功构建了ecl适配体传感器并成功应用于电子烟中mdpv的检测。在这项工作中cn202210330377.8，通过静电吸附将sn-tcpp网络聚合物层固定在mil-68表面以获得强大而稳定的ecl信号，当存在少量mdpv时，核酸适配体传感器的ecl信号明显猝灭，利用信号“关”模式检测，拓展了电化学发光法的在电子烟的检测中的实际应用前景。

3、而对于构建夹心型适配体传感器，传统的免疫夹心型传感器的成本高、稳定性差以及不易储存等限制。因此，如何设计出检测合成卡西酮mdpv的夹心型适配体传感器，通过增强ecl信号，利用信号“开”模式进行检测，并根据ecl信号的增强值来反映检测物浓度，是本发明所要解决的技术问题。

技术实现思路

1、针对合成卡西酮mdpv检测现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测合成卡西酮mdpv的夹心型电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、本发明利用共反应促进剂sns2纳米片和发光体ptca-cof共同修饰在玻碳电极表面，获得ptca-cof/sns2/gce修饰电极；同时将适配体sf负载于复合材料ptca-cof/sns2修饰的玻碳电极的表面，制得sf/ptca-cof/sns2/gce电化学发光适配体传感器，然后再加入含有lf-pt@ni-co材料的合成卡西酮mdpv溶液。在检测物mdpv存在的情况下，适配体sf和lf特异性结合形成三元夹心型结构，使得电催化剂pt@ni-co接触到sf/ptca-cof/sns2/gce电极表面，进一步放大系统的ecl信号，因此lf-pt@ni-co/mdpv/sf/ptca-cof/sns2/gce电化学发光适配体传感器的ecl信号值出现明显上升，能够实现对mdpv的检测。加入其他干扰物后发现该适配体传感器具有良好的特异性。

4、本发明还提供了上述用于检测合成卡西酮的夹心型电化学发光适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：

5、将适配体sf负载在ptca-cof/sns2复合材料修饰的玻碳电极表面的具体方法为：首先向含有kcl、nacl、mgcl2和乙二胺四乙酸的tris-hcl缓冲溶液中加入适配体sf，配制适配体sf浓度为1～5μm的适配体溶液，然后移取所述适配体溶液并将其滴涂在所述ptca-cof/sns2复合材料修饰的玻碳电极表面。自然晾干，制得sf/ptca-cof/sns2/gce，适配体sf是含有nh2-(ch2)6-gggtagggcgggaagttactgtcttactgtcgta碱基序列的适配体。

6、进一步的，适配体溶液中适配体sf的浓度为2μm，该浓度下便于保证更好的电化学发光强度。进一步的，适配体溶液中适配体sf的滴涂量为4μl。

7、进一步的，复合材料ptca-cof/sns2修饰玻碳电极的制备方法，包括如下步骤：

8、(1)制备ptca-cof；

9、首先，将三聚氰胺(ma)以5℃/min的加热速率加热至425℃，并在425℃下煅烧4h，收集煅烧后的颗粒以供进一步使用，暂命名为melem；然后再将上述颗粒melem和苝-3，4，9，10-四羧酸二酐(ptcda)混合并充分研磨30min。接下来，将上述合成的混合物以5℃/min的升温速率加热至325℃，并在325℃下煅烧4h即得ptca-cof材料。其中，ptcda和melem的质量比为3.1：1。

10、(2)sns2纳米片的制备：

11、首先，将五水合氯化锡(sncl4·5h2o)分散到去离子水中，并磁力搅拌以形成透明溶液；然后加入硫脲并将混合物转移到高压釜中，并在180℃下保持24h。将所得黄色沉淀物以8000rpm离心3min，并分别用去离子水和乙醇洗涤三次。最后将材料在60℃下干燥过夜，即所得sns2纳米片。其中，五水合氯化锡和硫脲的质量比为7：8。

12、(3)将ptca-cof和sns2纳米片分别分散于dmf中，超声使其分散均匀，得到ptca-cof分散液和sns2纳米片的分散液；然后将sns2纳米片和发光体ptca-cof的分散液依次修饰在洁净的玻碳电极表面，即先修饰sns2纳米片，再修饰ptca-cof，自然晾干得到复合材料ptca-cof/sns2修饰的玻碳电极。

13、进一步的，步骤(3)中洁净的玻碳电极的清洁方法包括：将玻碳电极抛光，依次用硝酸溶液、乙醇溶液和超纯水超声清洗，室温下吹干。

14、进一步的，步骤(3)中ptca-cof的dmf分散液的浓度为1mg/ml，滴涂量为4μl；sns2纳米片的dmf分散液的浓度为0.25mg/ml，ptca-cof与sns2纳米片的质量比为4:0.7～1。

15、本发明还提供了构建上述夹心型电化学发光适配体传感器中的纳米盒状结构的电催化剂pt@ni-co材料以及负载适配体lf的制备方法，包括如下步骤：

16、(1)pt@ni-co的制备：首先，将co(no3)2·6h2o溶解在含有的十六烷基三甲基溴化铵的去离子水中，然后将溶液快速注入含有2-甲基咪唑超纯水中，并搅拌20min，随后离心、洗涤、干燥后收集所得zif-67颗粒备用。将的zif-67分散于乙醇中，然后加入含有ni(no3)2·6h2o的乙醇溶液中，并搅拌10min，然后置于超声水浴中60min，随后离心、乙醇洗涤后收集所得ni-co ldh颗粒备用。最后，将制备好的ni-co ldh分散于的去离子水中，搅拌后加入的k2ptcl2溶液。待溶液充分混合后，加入的聚吡咯烷酮溶液中混合超声后，再缓慢滴加nabh4溶液，并在室温下搅拌30min后离心、洗涤、干燥得到pt@ni-co。zif-67、ni(no3)2·6h2o的质量比为：30：50；ni-co ldh和k2ptcl2的质量比为2：0.7。

17、(2)lf-pt@ni-co的制备方法：首先，将pt@ni-co分散在tris-hcl缓冲液中并超声处理直至获得均匀溶液。随后，将适配体lf溶液与pt@ni-co溶液混合并摇晃12h，适配体的-sh基团与pt@ni-co通过pt-s键连接，并将6-巯基-1-己醇(mch)加入到上述溶液中以封闭活性位点。最后，将所得混合物离心，用超纯水彻底冲洗以除去未结合的lf适配体，并重新分散在1mltris-hcl缓冲液中，然后储存在4℃下以备进一步使用。

18、进一步的，步骤(2)中所述的适配体lf为含有

19、sh-(ch2)6-tacgactcaggctttgccgggtatgactcaggctttgccgggta acaggg碱基序列的适配体。

20、进一步的，步骤(2)中所述的适配体lf溶液的具体配制方法为：向含有kcl、nacl、mgcl2和乙二胺四乙酸的tris-hcl缓冲溶液中加入适配体lf，配制浓度为10μm的适配体lf溶液。将10μm的适配体lf溶液与上述含有1mg pt@ni-co溶液混合按体积1:1混合。

21、本发明还提供了基于夹心型电化学发光适配体传感器检测合成卡西酮的方法，包括如下步骤：

22、步骤1，含k2s2o8的pbs缓冲溶液的配制：

23、用ph为7.4的0.1mol/l的pbs缓冲溶液配制含0.05mol/lk2s2o8的pbs缓冲溶液；

24、步骤2，不同浓度的mdpv标准溶液的配制：

25、将浓度为1.0×10-4g/l的mdpv母液用含有适配体lf的pt@ni-co的tris-hcl缓冲溶液进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的mdpv标准溶液，mdpv标准溶液的浓度范围为1.0×10-12～1.0×10-6g/l；

26、步骤3，标准曲线的绘制：

27、将等量的按照步骤2配制的含有适配体lf的pt@ni-co的不同浓度的mdpv标准溶液修饰在sf/ptca-cof/sns2/gce电化学发光适配体传感器上并反应相同时间，使电化学发光适配体传感器结合mdpv，然后以

28、lf-pt@ni-co/mdpv/sf/ptca-cof/sns2/gce作为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极体系，以步骤1中的含k2s2o8的pbs缓冲溶液为电解液，在-1.7～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压700v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录发光强度-时间曲线，建立电化学发光适配体传感器结合mdpv前后的发光强度差值(δecl)与mdpv标准溶液中的mdpv浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；

29、步骤4，样品中mdpv的检测

30、所述样品先经过预处理后，用含有lf-pt@ni-co的tris-hcl缓冲溶液将样品进行稀释后，通过标准添加法向稀释后的电子烟溶液中分别加入不同量的mdpv的标准溶液，然后按照步骤3将其修饰在电化学发光适配体传感器表面反应相同时间，使电化学发光适配体传感器结合mdpv，然后采用步骤3方法检测发光强度，再根据线性回归方程计算出样品中mdpv的浓度。

31、进一步的，步骤3中所述的mdpv的用量为4μl，反应时间为30min。

32、进一步的，pt@ni-co与ptca-cof、sns2的用量关系为2～4：4：0.7～1。

33、本发明的有益效果有：

34、制备的sns2纳米片可以用作共反应促进剂，加速k2s2o8的还原以产生更强的ecl发射，同时负载在gce表面提高电化学活性面积。另外，由于三元金属的协同作用和独特的中空盒状结构，所制备的pt@ni-co展现出较好的催化能力并进一步提升ecl性能和增加传感器的灵敏度。因此sns2纳米片和pt@ni-co作为双共反应促进剂具有优异的电化学性能，成功建立起具有高度稳定性和特异性的夹心型电化学发光适配体传感器并用于电子烟中的mdpv的检测。

35、本发明设计了一种基于苝四羧酸二酐的共价有机框架ptca-cof与非金属硫化物sns2纳米片复合材料的电化学发光适配体传感器，两种材料依次修饰在电极表面，从而创建一种理想的ecl基底材料并保证了适配体sf的固定化。同时制备了适配体lf标记的中空纳米盒状pt@ni-co作为电催化剂，进一步增强ecl信号。在检测物mdpv存在的情况下，适配体sf和lf特异性结合形成夹心型三元络合物，成功建立起具有高度稳定性和特异性的电化学发光传感器。该发明充分利用了适配体和电化学发光传感器的独特优势，通过检测物mdpv对该体系ecl信号的增强效应，成功实现对mdpv的灵敏检测，实验证明该传感平台可特异性识别检测物mdpv。本发明的检测范围为1.0×10-12～1.0×10-6g/l，最低检测限为1.07×10-13g/l。本发明检测mdpv的操作简单、选择性好、灵敏度高、检测范围宽，对推广适配体传感器在实际检测方面的应用具有重要的意义。