一种胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化工艺及其应用

本发明属于胰岛分离提纯，具体为一种胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化工艺及其应用。

背景技术：

1、胰岛移植是一种治疗1型糖尿病的有效方法。1型糖尿病是一种由于胰岛细胞被自身免疫系统破坏而导致的胰岛素分泌不足的疾病。胰岛移植通过将健康的胰岛细胞移植到患者体内，以恢复胰岛素的分泌，从而达到治疗糖尿病的目的。胰岛移植的适应症主要包括1型糖尿病、2型糖尿病并发症、其他药物治疗无效的糖尿病等。在移植前，患者需要进行详细的评估和筛选，以确保移植的安全性和有效性。胰岛移植的供体通常选择健康的人体，并经过严格的筛选和检测，确保供体无传染性疾病和遗传病。供体胰腺中的胰岛细胞被提取出来，经过纯化处理，以提高胰岛细胞的纯度和活性。其中胰岛分离提纯是整个过程的关键步骤。分离提纯的目的是从胰腺中提取胰岛细胞，并去除杂质，提高胰岛细胞的纯度和活性。

2、但是常见的分离纯化工艺不能通过提高胰岛细胞的纯度和活性，为移植成功提供保障，从而使得整体移植后的并发症较多。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化工艺及其应用。

2、本发明采用的技术方案如下：一种胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化工艺及其应用，所述工艺包括以下步骤：

3、s1：供体胰腺的获取与保存：获取来源于器官捐献者新鲜的供体胰腺；

4、s2：将胰腺置于无菌的uw液保存液中以保持胰岛细胞的活性；

5、s3：进行胰腺的清洗与消化：使用无菌的生理盐水冲洗胰腺，去除血块和其他杂质；

6、s4：使用胶原酶和蛋白酶抑制剂的混合溶液对胰腺进行消化，以分离胰岛细胞；

7、s5：进行胰岛的筛选与纯化：通过离心法将消化后的胰腺细胞悬液分离成重、轻两层，胰岛细胞位于轻层；

8、s6：使用密度梯度离心法进一步纯化胰岛细胞，以去除其他细胞和杂质，通过细胞筛网过滤，如400微米的筛网，以去除较大的组织碎片；

9、s7：进行胰岛的洗涤与培养，使用无菌的生理盐水或培养液洗涤纯化后的胰岛细胞，以去除残留的消化酶和细胞碎片；

10、s8：将胰岛细胞转移到含有营养培养基的培养皿中，如rpmi 1640或dmem，以促进细胞的存活和增殖；

11、s9：进行胰岛的活性评估与计数：使用台盼蓝染色法或其他细胞活性染色法评估胰岛细胞的存活率。使用显微镜和细胞计数板对胰岛细胞进行计数，以确保移植所需的最小胰岛数量；

12、s10：进行胰岛的移植，将洗涤后的胰岛细胞悬浮在含有抗生素的生理盐水中，以防止感染，通过注射器将胰岛细胞移植到受体的门静脉或肝脏中，或通过腹腔镜手术进行胰岛移植。

13、在一优选的实施方式中，所述步骤s1中，胰腺应在死后30分钟内获取，以保持胰岛细胞的活性；使用无菌技术将胰腺置于冷的无菌保存液中，为uw液或celsior液。

14、在一优选的实施方式中，所述步骤s2中，celsior液的成分包括：乳糖酸、羟乙基淀粉、甘露醇、棉糖和乳糖。保存液的温度应保持在0-4℃，以减缓细胞代谢和保持细胞活力。胰腺在保存液中浸泡并运输到实验室。

15、在一优选的实施方式中，所述步骤s3中，使用无菌的生理盐水(0.9％nacl)冲洗胰腺，去除血块和其他杂质。清洗过程应在低温(4℃)下进行，以减少细胞损伤。

16、在一优选的实施方式中，所述步骤s4中，使用v型胶原酶和edta的混合溶液，胶原酶浓度为1-2mg/ml，edta浓度为1-5mm，消化过程在37℃下进行，持续约30—60分钟，以分离胰岛细胞。

17、在一优选的实施方式中，所述步骤s5中，通过离心法(通常在1000-2000g下离心10—15分钟)将消化后的胰腺细胞悬液分离成重、轻两层，胰岛细胞位于轻层。

18、在一优选的实施方式中，所述步骤s6中，梯度离心溶液包括：

19、120重量份蔗糖或聚蔗糖：作为主要成分，用于创建密度梯度。

20、20重量份氯化钠：用于调节溶液的渗透压。

21、20重量份磷酸盐或hepes：作为缓冲剂，用于维持溶液的ph稳定。

22、500重量份水：作为溶剂。

23、梯度离心溶液的浓度通常在15％—20％之间，离心参数通常为室温下800-1200g离心20—30分钟；

24、使用密度梯度离心法进一步纯化胰岛细胞的流程方法如下：

25、准备梯度离心溶液：根据厂商的说明书，准备适当浓度的梯度离心溶液。通常，梯度离心溶液的浓度在15％—20％之间，而percoll溶液的浓度则在10％—20％之间。

26、制备密度梯度：在离心管底部加入一定量的梯度离心溶液。轻轻覆盖一层无菌的生理盐水或细胞培养液，以形成密度梯度。

27、细胞悬液的制备：将之前消化并离心得到的胰岛细胞悬液收集起来。将细胞悬液轻轻叠加到密度梯度上层，避免混合层。

28、离心：将离心管放入离心机中，以使400-1200g和室温4℃离心。离心时间在15—30分钟之间，具体时间取决于离心速度和所需的分离效果。

29、收集胰岛细胞：离心后，可以观察到离心管内形成不同层次的液体和细胞带。使用无菌的吸管小心地收集位于密度梯度中间的胰岛细胞层。将收集的胰岛细胞转移到新的离心管中。

30、洗涤胰岛细胞：使用无菌的生理盐水或细胞培养液洗涤收集的胰岛细胞，以去除残留的梯度离心溶液和其他杂质。通过200g低速离心收集胰岛细胞，并重复洗涤步骤1—2次。

31、最终胰岛细胞的收集与计数：将洗涤后的胰岛细胞悬浮在适量的细胞培养液中。使用显微镜和细胞计数板对胰岛细胞进行计数，以评估细胞数量和活性。

32、在一优选的实施方式中，所述步骤s7中，使用无菌的生理盐水或含有抗生素的细胞培养液(如rpmi 1640或dmem)洗涤纯化后的胰岛细胞，洗涤过程在室温下进行，通常重复2—3次，每次离心5—10分钟。

33、在一优选的实施方式中，所述步骤s8中，使用含有10％胎牛血清、抗生素(如青霉素和链霉素)和葡萄糖的rpmi 1640或dmem培养基，培养基的ph应调整至7.4，并在37℃、5％co2的培养箱中培养。

34、在一优选的实施方式中，所述步骤s10中，将洗涤后的胰岛细胞悬浮在含有抗生素的生理盐水中，以防止感染，通过注射器将胰岛细胞移植到受体的门静脉或肝脏中，或通过腹腔镜手术进行胰岛移植，移植过程应在无菌条件下进行，以减少感染风险。

35、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

36、1、本发明中，密度梯度离心法能够有效地将胰岛细胞与其他细胞(如胰腺外分泌细胞、红细胞、淋巴细胞等)和杂质(如消化酶、组织碎片等)分离开来。由于不同细胞的密度不同，梯度离心溶液能够创建一个密度梯度，使得胰岛细胞在梯度中特定的位置集中，从而提高胰岛细胞的纯度。梯度离心溶液对胰岛细胞具有较好的保护作用，能够减少在离心过程中由于机械力导致的细胞损伤。这种保护有助于维持胰岛细胞的活性和功能，为后续的胰岛移植提供高质量的细胞。通过密度梯度离心法获得的较高纯度的胰岛细胞，可以减少移植后免疫排斥反应的发生，提高胰岛移植的成功率。高纯度的胰岛细胞意味着较少的非胰岛细胞，这些非胰岛细胞可能会引起不必要的免疫反应。纯化后的胰岛细胞更容易进行准确计数，这对于确保移植所需的最小胰岛数量至关重要。准确的细胞计数有助于预测移植效果，为患者提供个性化的治疗方案。通过去除其他细胞和杂质，密度梯度离心法有助于减少移植后可能发生的感染和其他并发症的风险。这是因为减少了可能携带病原体的其他细胞和污染物的数量。

37、2、本发明中，在整个工艺中，特别是在保存液的使用、消化过程和洗涤步骤中，都采取了措施来保持胰岛细胞的活性。这包括使用适当的保存液(如uw液或celsior液)、在低温下处理细胞，以及使用无菌技术等。

38、提高移植效果：通过纯化和活性评估步骤，可以确保只有活性和功能良好的胰岛细胞被移植。这有助于提高移植后胰岛细胞的存活率和功能，从而提高移植治疗糖尿病的效果。

39、减少免疫反应：纯化工艺中去除非胰岛细胞和其他杂质可以减少移植后的免疫排斥反应。免疫系统的攻击减少意味着胰岛细胞更容易在宿主体内定居和发挥作用。

40、降低感染风险：在整个工艺中，特别是在洗涤和培养步骤中使用抗生素，以及在移植前将胰岛细胞悬浮在含有抗生素的生理盐水中，都有助于减少感染的风险。