一种线纹香茶菜入血成分和入肝成分的定性检测方法

本发明属于药物分析，具体涉及一种线纹香茶菜入血成分和入肝成分的定性检测方法。

背景技术：

1、线纹香茶菜(isodon lophanthoides(buch.-ham.ex d.don)h.hara)为唇形科香茶菜属植物，为溪黄草的一种重要基原；主产于广东、广西等地。俗称“肝草”，归肝、胆经，具有清热利湿、退黄、凉血散瘀的功效，临床上常用于治疗黄疸型肝炎、乙型肝炎等疾病。在“血清药物化学”理论基础上，我国学者王喜军教授提出了中药血清药物化学的理论。中药化学成分复杂，口服后部分成分吸收入血或运输到靶器官发挥效应。线纹香茶菜具有保肝、抗炎作用，常用于治疗肝炎等肝脏相关疾病，肝脏是线纹香茶菜的代谢器官，也是其重要的靶器官之一。

2、体内成分如入血成分、入肝成分与药材成分不同。《基于uplc-q-tof-ms技术的紫丁香化学成分及入血成分研究》(中药材，2023，46(4)：892-902)公开了紫丁香中共鉴定出38个化学成分，包括酚酸类、苯丙素类、倍半萜类、五环三萜类、木脂素类以及其他类成分。大鼠口服紫丁香提取物后，血浆样本共鉴定出40个入血成分，包括14个原型成分和26个代谢产物。代谢产物发生ⅰ相代谢主要为脱水和去甲基化反应，ⅱ相代谢主要为葡萄糖醛酸化和甲基羧酸化反应。药物原型成分吸收后会经不同代谢途径进行生物转化，而后吸收入血或运输至靶器官，由此获得不同结构的入血成分、入靶器官成分。肝脏是线纹香茶菜的重要靶器官之一，用于药物成分原型的检测方法不一定适用于入血、入肝成分的检测。

3、线纹香茶菜的入血、入肝成分定性检测尚无文献报道，仅有1篇论文提及线纹香茶菜提取物的定性分析。《基于uplc-q-tof-ms和uplc-dad的不同品种溪黄草主要化学成分分析》(中国中药杂志，2022，47(13)：3539-3547)公开了线纹香茶菜经粉碎、甲醇超声提取，微孔滤膜过滤后采用uplc-q-tof-ms联用检测。其中，waters acquity uplc beh c18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相0.1％甲酸水-甲醇，梯度洗脱，流速0.3ml/min；离子源esi，扫描方式esi+模式；雾化气压力379.23kpa；辅助气压力379.23kpa；气帘气压力341.33kpa；雾化温度500℃；源喷雾电压5.5kv；解触电压100v；碰撞能45v；碰撞活化扫描15v；扫描范围m/z 100～1500。该技术能定性检测线纹香茶菜中的咖啡酸、槲皮素、诺多星、异鼠李素、epinodosinol、拉西多宁、毛栲利素、shikokianidin或同分异构体。该技术方案仅在正离子模式下检测了线纹香茶菜化学成分，同步检测化合物数量少，且不一定适合检测进入血液或肝脏的成分。

4、因此，现有技术对线纹香茶菜化学成分的定性检测，不能充分反映药物入血、入肝及起效的情况，还尚未有针对线纹香茶菜入血、入肝成分的定性检测技术方案报道。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明提供一种线纹香茶菜入血成分和入肝成分的定性检测方法，采用超高效液相色谱-串联质谱法检测出线纹香茶菜入血成分13种、入肝成分7种，为进一步研究药物代谢周期及代谢途径提供基础。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种线纹香茶菜入血成分和入肝成分的定性检测方法，包括以下步骤：

4、(1)给予实验组以线纹香茶菜药液，预定时间后采集离体血浆样品和离体肝脏样品；

5、(2)给予对照组以等量的生理盐水，预定时间后采集离体血浆样品和离体肝脏样品；

6、(3)对采集到的实验组和对照组的离体血浆样品、离体肝脏样品分别进行处理；

7、(4)采用超高效液相色谱-串联质谱法对处理后的实验组和对照组的离体血浆样品、离体肝脏样品分别进行检测分析，基于所得到的检测结果确定线纹香茶菜的入血成分和入肝成分；

8、所述入血成分包括：高香草酸、乌拉尔新苷、7-羟基香豆素、咖啡酸、新西兰牡荆苷、夏佛塔苷、芹菜素-6,8-二-c-α-l-吡喃阿拉伯糖苷、迷迭香酸、葛根素-6″-o-木糖苷、异泽兰黄素、疏花乙素、6,12,15-trihydroxy-5,8,11,13-abietetriene-7-one和香茶菜甲素；

9、所述入肝成分包括：高香草酸、原儿茶醛、葛根素-6″-o-木糖苷、疏花乙素、6,12,15-trihydroxy-5,8,11,13-abietetriene-7-one、苜蓿酸和香茶菜甲素。

10、进一步地，步骤(4)中，所述超高效液相色谱-串联质谱法的色谱条件包括：采用acquity prm hss t3 fit色谱柱，以0.05～0.2％甲酸-水为流动相a，以0.05～0.2％甲酸-乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，流速为0.3～0.5ml/min，柱温为20～40℃。

11、进一步地，所述梯度洗脱的程序为：0～3min，5％ b；3～10min，5～10％ b；10～20min，10～30％ b；20～30min，30～65％ b。

12、进一步地，步骤(4)中，所述超高效液相色谱-串联质谱法的质谱条件包括：电喷雾离子源，正离子扫描，毛细管电压为2.0～4.0kv；负离子扫描，毛细管电压为1.5～3.5kv；离子源温度为100～160℃，锥孔电压为30～50v，锥孔气流量为40～60l/h，脱溶剂氮气流量为500～700l/min，氩气流量为0.1～0.3ml/min，碰撞能量6～35v，辅助气压力为40～60psi，帘气压力为30～40psi，质量范围m/z 50～1500da。

13、进一步地，步骤(3)中，所述离体血浆样品的处理包括：分别移取实验组和对照组的离体血浆样品，加入乙腈，涡旋，离心，取上清液，氮气吹干，之后用甲醇超声提取，离心，取上清液进行检测分析。

14、进一步地，步骤(3)中，所述离体肝脏样品的处理包括：分别提取实验组和对照组的离体肝脏样品，加入生理盐水和研磨球，研磨，离心，取上清液，然后加入乙腈，涡旋，离心，取上清液，离心浓缩干燥，之后用甲醇超声提取，离心，取上清液进行检测分析。

15、进一步地，步骤(1)中，所述线纹香茶菜药液的制备方法包括：取线纹香茶菜，加入7～9倍的水进行煎煮提取2～3次，合并滤液，浓缩得到线纹香茶菜浸膏，取适量线纹香茶菜浸膏，加入适量生理盐水，配制成线纹香茶菜药液。

16、进一步地，所述线纹香茶菜药液的质量浓度为0.3～0.5g/ml。

17、进一步地，步骤(1)中，所述线纹香茶菜药液的给药剂量为8～12ml/kg。

18、与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

19、1、本发明建立了采用超高效液相色谱-串联质谱法检测线纹香茶菜入血成分、入肝成分方法，由该方法检测出线纹香茶菜入血成分13种、入肝成分7种，由此更能反映药物入血、入肝后的药源性成分情况，弥补了线纹香茶菜入血、入肝成分的定性检测方面的空白，为进一步研究药物代谢周期及代谢途径提供基础，还为线纹香茶菜定量检测方法的建立奠定基础。

20、2、本发明采用超高效液相色谱-串联质谱法能检测线纹香茶菜中13种入血成分、7种入肝成分，同步检测出的化合物数量多，所检测的入血成分、入肝成分涵盖酚酸类、黄酮类、二萜类、三萜类，通过对入血成分、入肝成分进行鉴别，有助于阐释线纹香茶菜口服吸收进入体内后发挥药效的成分，反推这些原型可以作为线纹香茶菜质量标准提升的关键指标。

21、3、本发明建立的检测方法所需时间短，采用超高效液相色谱-串联质谱法进行检测只需30min即可完成，检测速度快，准确度高，能准确可靠地同时检测出线纹香茶菜入血成分、入肝成分中的多种化合物，且前处理方法简单，整体方法容易操作，适合推广应用。