一种水体中类5-HT受体调节剂活性分子的筛查方法和定量方法

本发明涉及分析检测，具体涉一种水体中类5-ht受体调节剂活性分子的筛查方法和定量方法。

背景技术：

1、5-ht受体，也被称为5-羟色胺受体或血清素受体，是位于动物中枢神经和周围神经系统的g蛋白偶联受体(gpcr)和配体门控离子通道(lgic)，同时调节兴奋性和抑制性神经传导物质的传递，参与调节情绪、体温平衡、睡眠和心理应激的反应水平，也调节自我控制和认知功能，不仅与帕金森病、精神分裂症、阿尔茨海默病、双相情感障碍等神经系统相关疾病紧密相关，也与毒品成瘾形成的重要机制相关。5-ht受体调节剂是指与5-ht受体结合、对5-ht受体的功能起到调节作用的物质，类5-ht受体调节剂活性分子则是指具有类似与5-ht受体调节剂的神经活性的分子，比如：尼古丁、色胺、5-羟基色胺、利扎曲坦、氟伏沙明、马普替林、去甲替林、阿米舒必利、依匹斯汀、度洛西汀、氟西汀中等。

2、随着人类的生产生活的进行，类5-ht受体调节剂活性分子早已排入水体环境中，对水体造成了严重污染，也对人类健康和生态环境造成了严重威胁。因此，需要高度关注类5-ht受体调节剂活性分子在水体中分布和含量。而水体环境的复杂性增加了水体中类5-ht受体调节剂活性分子筛查和定量检测的困难度，现有方法用于水体环境时，由于对类5-ht受体调节剂活性分子的选择性较差，而导致水体中类5-ht受体调节剂活性分子的筛查变得困难，因此，开发一种对类5-ht受体调节剂活性分子选择性高的类5-ht受体调节剂活性分子的筛查方法和定量方法是具有重要意义的。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是解决现有技术对水体中类5-ht受体调节剂活性分子选择性较差的问题，而提供一种水体中类5-ht受体调节剂活性分子的筛查方法。

2、本发明的另一目的是提供一种水体中类5-ht受体调节剂活性分子的定量方法。

3、为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

4、一种水体中类5-ht受体调节剂活性分子的筛查方法，包括以下步骤：

5、s1.对水体进行固相萃取，浓缩得到水体浓缩液；

6、s2.采用lc-ms对水体浓缩液和浓度为20～50μm/l的羟基合成肽溶液进行分析，并利用lc-ms谱图制作火山图，对信号上调的可疑信号进行靶向二级分析，并与质谱数据库进行匹配，鉴定水体中类5-ht受体调节剂活性分子的种类；

7、步骤s2中所述羟基合成肽为羟基环肽或羟基线肽中的一种；

8、所述羟基环肽具有式(1)所示分子结构：

9、

10、所述羟基线肽具有式(2)所示分子结构：

11、

12、本发明利用羟基合成肽的空腔尺寸选择性、及其与类5-ht受体调节剂活性分子之间的氢键作用，使羟基合成肽选择性地与类5-ht受体调节剂活性分子发生相互作用形成复合物，提高了对水体中类5-ht受体调节剂活性分子的选择性，从而在复杂基质水体中实现类5-ht受体调节剂活性分子的筛查。

13、发明人在前期研究中发现，环肽1和线肽这种无羟基的合成肽与类多巴胺活性分子结合的选择性远强于其与类5-ht受体调节剂活性分子结合的选择性。为了更好地对水体中类5-ht受体调节剂活性分子进行筛查，提高合成肽对类5-ht受体调节剂活性分子的选择性，发明人通过计算理性设计，制备得到了羟基合成肽。羟基合成肽中的羟基-oh能够影响多肽的空腔以及与小分子作用的氢键位点，从而提高合成肽对类5-ht受体调节剂活性分子的选择性，进而有利于在复杂基质水体中实现类5-ht受体调节剂活性分子的筛查。

14、环肽1具有式(3)所示分子结构：

15、

16、线肽具有式(4)所示分子结构：

17、

18、在本发明中，羟基环肽和羟基线肽均为商购。

19、在本发明中，羟基合成肽溶液的溶剂为甲醇、乙腈、体积分数为0.1～5％的三氟乙酸的乙腈溶液、体积分数为0.1～5％的甲酸的乙腈溶液、体积分数为0.1～5％的乙酸的乙腈溶液、体积分数为0.1～5％的三氟乙酸的甲醇溶液、体积分数为0.1～5％的甲酸的甲醇溶液或体积分数为0.1～5％的乙酸的甲醇溶液中的一种或多种。

20、本发明根据lc-ms谱图的保留时间和离子丰度，利用metaboanalyst软件绘制火山图。

21、优选地，步骤s2中所述羟基合成肽为羟基环肽。

22、优选地，所述类5-ht受体调节剂活性分子为尼古丁、色胺、5-羟基色胺、利扎曲坦、氟伏沙明、马普替林、去甲替林、阿米舒必利、依匹斯汀、度洛西汀或氟西汀中的一种或多种。

23、在本发明中，所述水体为水样，可以是河水水样、海水水样。

24、优选地，步骤s1中所述水体浓缩液的浓缩倍数为250～2000倍。

25、优选地，步骤s1中所述水体浓缩液在低于4℃下保存。

26、优选地，所述步骤s1具体为先用有机溶剂冲洗固相萃取柱，再往固相萃取柱中注入水体，再用有机溶剂洗脱，得到洗脱液，干燥，接着用有机溶剂复溶，过滤，得到水体浓缩液。

27、更为优选地，所述有机溶剂为甲醇、乙腈、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇或水中的一种或多种。

28、更为优选地，所述固相萃取柱为c18固相萃取小柱、hlb固相萃取柱、c8固相萃取柱或slc固相萃取柱中的一种或多种。

29、在本发明中，步骤s1中所述干燥可以是用惰性气体吹干洗脱液，也可以是通过旋蒸干燥洗脱液，还可以是真空干燥洗脱液；使用的惰性气体为氮气或氩气中的一种或两种。

30、优选地，所述采用lc-ms对水体浓缩液和浓度为20～50μm/l的羟基合成肽溶液进行分析是指，水体浓缩液先通过lc进行分离，然后与浓度为20～50μm/l的羟基合成肽溶液通过三通阀混合进入ms。

31、优选地，所述浓度为20～50μm/l的羟基合成肽溶液进入lc-ms的流速为10～25μl/min。

32、本领域的常规lc-ms均可用于本发明水体中类5-ht受体调节剂活性分子的筛查方法，比如步骤s2中的所述lc-ms可以为uhplc-qtof/ms。

33、当步骤s2中的所述lc-ms为uhplc-qtof/ms时，其分析条件为：

34、色谱柱：zorbax eclipse plus c18、zorbax-sb-c18或poroshell 120ec-c18；流动相a相：纯水相、体积分数为0.1～5％异丙醇的水溶液、体积分数为0.1～20％甲醇的水溶液、体积分数为0.1～20％乙腈的水溶液、体积分数为0.1～5％乙酸的水溶液或体积分数为0.1％甲酸的水溶液；流动相b相：纯甲醇、纯乙腈、体积分数为0.1％甲酸的甲醇溶液、体积分数为0.1～5％甲酸的乙腈溶液、体积分数为0.1～5％乙酸的甲醇溶液或体积分数为0.1～5％乙酸的乙腈溶液；流动相a相跟b相的流速：0.2～0.5ml/min；喷嘴电压：0～1000v；雾化器压力：30～50psi；干燥器流速：8～11l/min；干燥器温度：300～350℃；毛细管电压：3500～4000v；采用sim模式分析。

35、在本发明水体中类5-ht受体调节剂活性分子的筛查方法中，流动相a相和流动相b相的梯度变化如下表所示：

36、表1筛查方法中流动相a相和流动相b相的梯度变化

37、

38、

39、注：上表中，流动相a相的体积分数是指流动相a相的体积占流动相a相和流动相b相的体积总和的百分数；流动相b相的体积分数是指流动相b相的体积占流动相a相和流动相b相的体积总和的百分数。

40、从表1可知，在0.00～1.00min内，流动相a相的体积分数保持95％，流动相b相的体积分数保持5％，流向废液；在1.00～5.00min内，流动相a相的体积分数从95％下降到65％，流动相b相的体积分数从5％上升到35％，流经质谱；在5.00～20.00min内，流动相a相的体积分数从65％下降到5％，流动相b相的体积分数从35％上升到95％，流经质谱；以此类推。

41、一种水体中类5-ht受体调节剂活性分子的定量方法，包括以下步骤：

42、利用水体中类5-ht受体调节剂活性分子的筛查方法鉴定水体中类5-ht受体调节剂活性分子的种类，得到类5-ht受体调节剂活性分子的具体种类，再利用lc-ms或gc-ms技术建立具体种类类5-ht受体调节剂活性分子的标准浓度曲线，通过计算即得水体中具体种类类5-ht受体调节剂活性分子的含量。

43、本领域的常规gc-ms或lc-ms可用于本发明水体中类5-ht受体调节剂活性分子的定量方法中，当使用gc-ms时，其gc-ms分析条件为：

44、质谱电离源：ei源；载气：高纯氦气；采用不分流模式进样；气相毛细管柱：hp-5ms、hp-5或db-5ms；进样口温度为200～300℃；传输线温度为230～250℃。

45、当使用lc-ms时，其lc-ms分析条件为：

46、色谱柱：zorbax eclipse plus c18、zorbax-sb-c18或poroshell 120 ec-c18；流动相a相：纯水相、体积分数为0.1～5％异丙醇的水溶液、体积分数为0.1～20％甲醇的水溶液、体积分数为0.1～20％乙腈的水溶液、体积分数为0.1～5％乙酸的水溶液或体积分数为0.1％甲酸的水溶液；流动相b相：纯甲醇、纯乙腈、体积分数为0.1％甲酸的甲醇溶液、体积分数为0.1％甲酸的乙腈溶液、体积分数为0.1～5％乙酸的甲醇溶液或体积分数为0.1～5％乙酸的乙腈溶液；流动相a相跟b相的流速：0.2～0.5ml/min；气帘气：20～40psi；离子化电压：5500v；离子源温度：200～550℃；喷雾器：40～60psi；辅助加热气：40～60psi；采用多反应监测模式(mrm)进行定量。

47、在本发明水体中类5-ht受体调节剂活性分子的定量方法中，流动相a相和流动相b相的梯度变化如下表所示：

48、表2定量方法中流动相a相和流动相b相的梯度变化

49、

50、注：上表中，流动相a相的体积分数是指流动相a相的体积占流动相a相和流动相b相的体积总和的百分数；流动相b相的体积分数是指流动相b相的体积占流动相a相和流动相b相的体积总和的百分数。

51、从表2可知，在0.00～2.00min内，流动相a相的体积分数从90％下降到10％，流动相b相的体积分数从10％上升到90％，维持2min；在4.00～4.10min内，流动相a相的体积分数从10％上升到90％，流动相b相的体积分数从90％下降到10％；以此类推。

52、本发明利用羟基合成肽建立的定量方法能够实现水体中类5-ht受体调节剂活性分子的定量检测。

53、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

54、本发明利用羟基合成肽的空腔尺寸选择性、及其与类5-ht受体调节剂活性分子之间的氢键作用，使羟基合成肽选择性地与类5-ht受体调节剂活性分子发生相互作用形成复合物，提高了对水体中类5-ht受体调节剂活性分子的选择性，从而在复杂基质水体中实现类5-ht受体调节剂活性分子的筛查和定量检测。

55、相比于无羟基的合成肽(环肽1、线肽)，本发明的羟基合成肽对类5-ht受体调节剂活性分子具有更强的选择性，能够更好地在复杂基质水体中实现类5-ht受体调节剂活性分子的筛查。