一种布鲁氏菌DNA荧光PCR检测试剂盒的制作方法

本发明涉及临床检测，尤其涉及一种布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒。

背景技术：

1、布鲁氏菌病（brucellosis）是由布鲁氏菌属（brucella）细菌感染引起的一种人兽共患的传染性疾病，在全世界有广泛的分布。布鲁氏菌病在国外也被称为地中海热、马尔他热和山羊热等。早在 1886 年，在大英帝国驻扎于地中海沿岸的军队中流行，1位英国的军医布鲁氏 (bruce) 在马尔他岛死于“马尔他热”。目前公认布鲁氏菌属的细菌有6种19型，感染人的主要有牛、羊、猪3种16型。人感染布鲁氏菌可引起发烧、多汗、全身乏力、关节疼痛等症状、病程长且反复发作，如得不到及时有效治疗，转变为慢性期，导致骨关节、神经、泌尿、生殖等多系统损害、疾患。家畜患病可导致流产、不孕、睾丸炎和附睾炎等症状。世界动物卫生组织（office international des epizooties，oie）将其列为b类重要传染病。感染动物是其它动物和人类罹患布鲁氏菌病的主要传染源。对布鲁氏菌病的早期特异诊断为防控的关键技术之一。因此，快捷准确鉴定的检测并鉴定病患是否感染布鲁氏菌，对临床诊治和疫情有效防控具有重大意义。

2、布鲁氏菌病的实验室诊断方法主要有：病原体分离，但因布鲁氏菌生长较慢，即使是快速的bactec9240血培养系统，也需2～7天检出，经孵育2～4周后仍无细菌生长，才能判为阴性，难以早期快速诊断。免疫学检查，包括血清凝集试验、酶联免疫吸附试验、补体结合试验、被动血凝试验、间接免疫荧光试验、斑点免疫法和皮内试验等多种方法，由于受到宿主免疫反应机制的限制，也是在布鲁氏菌感染发病后2～3周开始出现阳性，灵敏度和特异度都不高，而且阳性时不能鉴别是现症患者还是既往感染，只能作为临床辅助诊断参考。

3、分子检测是目前公认的灵敏度和特异度都明显高于其他技术方法的病原学检测技术，在其他传染病检测中已得到广泛的应用。在分子检测技术中，pcr法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于pcr方法来说，引物探针的特异性是检测方法特异性和敏感性的基础。然而，在布鲁氏菌病方面，目前，我国临床诊断领域尚未见有相应的分子检测试剂。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供本一种布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒，解决如何快速准确地检测样品中是否存在布鲁氏菌的问题。

2、本发明的方案是：

3、一种布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒，包括酶反应液，引物探针混合液、阴性质控品与阳性质控品，所述引物探针混合液中用于布鲁氏菌特异dna扩增反应的上游引物bru-f与下游引物bru-r；所述引物探针混合液中用于指控内参扩增反应的上游引物β2m-f与下游引物β2m-r；所述引物探针混合液中用于荧光信号监测的布鲁氏菌目的基因寡核苷酸探针bru-p1；所述引物探针混合液中于荧光信号监测的β2m内参基因寡核苷酸探针β2m-p2；

4、所述上游引物bru-f的核苷酸序列如seq no.1所示，所述下游引物bru-r如seqno.2所示；

5、所述上游引物β2m-f的核苷酸序列如seq no.3所示，所述下游引物β2m-r的核苷酸序列如seq no.4所示；

6、所述探针bru-p1的核苷酸序列如seq no.5所示，所述探针β2m-p2的核苷酸序列如seq no.6所示。

7、作为优选的技术方案，qpcr反应体系为20μl的如下体系：

8、酶反应液10.0μl、引物探针混合液3.6μl、样品dna 3μl，加无核酸酶灭菌水至终体系 20 μl。

9、作为优选的技术方案，所述酶反应液包括pcr缓冲液、taq酶与dntps。

10、作为优选的技术方案，qpcr反应循环参数为95℃，30min；进入循环阶段：95℃变性10s，60℃退火延伸50s，共反应45个循环。

11、作为优选的技术方案，qpcr反应的目的基因（fam）阳性判断 ct值为≤39，内参基因（hex通道）阳性判断ct 值为≤38。

12、本发明还公开了一种布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒的用途，为布鲁氏菌的感染诊断与鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法，在所述临床检测方法中使用。

13、本发明的优点：

14、本发明分别针对布鲁氏菌基因序列的保守区域特异的靶序列（见图1）设计引物和taqman探针，阳性参照β2m基因序列（见图2）设计引物和taqman探针，利用荧光定量pcr（fluorescent quantitative pcr，qpcr）方法，用来快速检测样品中是否存在布鲁氏菌的核酸dna。

15、本发明提供的试剂具有很好的特异性，可以检出布鲁氏菌特异dna。本发明提供的试剂与副溶血弧菌、小肠结肠耶尔森菌致病株、小肠结肠耶尔森菌非致病株、大肠杆菌o157、沙门菌和结核杆菌无交叉反应。本发明提供的试剂，针对血红蛋白（2.0g/l）、甘油三酯（37mmol/l）、结合胆红素（342μmol/l）、游离胆红素（342μmol/l）进行验证，对检测结果无显著性影响。本发明提供的试剂，针对布鲁氏菌病治疗常用抗生素多西环素（10mg/l）、利福平（27mg/l）、链霉素（120mg/l）、环丙沙星（15mg/l）和左氧氟沙星（10mg/l）进行验证，药物本身对检测结果无显著性影响。临床样本检测的特异度，以普通pcr dna测序做参照，特异度达到91.7%。

16、本发明提供的试剂具有很好的灵敏性，对布鲁氏菌dna的检测下限为3拷贝每反应体系；临床样本检测的灵敏度，以普通pcr dna测序做参照，灵敏度达到97.5%。

17、本发明提供的试剂盒，检测时效快速，只需要2小时即可完成检测。

18、本发明提供的试剂盒，可对由布鲁氏菌引起的感染进行病原学监测并为临床诊断提供实验依据。

技术特征：

1.一种布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒，其特征在于：包括酶反应液，引物探针混合液、阴性质控品与阳性质控品，所述引物探针混合液中用于布鲁氏菌特异dna扩增反应的上游引物bru-f与下游引物bru-r；所述引物探针混合液中用于指控内参扩增反应的上游引物β2m-f与下游引物β2m-r；所述引物探针混合液中用于荧光信号监测的布鲁氏菌目的基因寡核苷酸探针bru-p1；所述引物探针混合液中于荧光信号监测的β2m内参基因寡核苷酸探针β2m-p2；

2.如权利要求1所述一种布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，qpcr反应体系为20μl的如下体系：

3.如权利要求1或2所述一种布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒，其特征在于：所述酶反应液包括pcr缓冲液、taq酶与dntps。

4.如权利要求2所述一种布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒，其特征在于：qpcr反应循环参数为95℃，30min；进入循环阶段：95℃变性10s，60℃退火延伸50s，共反应45个循环。

5.如权利要求2所述一种布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒，其特征在于：qpcr反应的目的基因阳性判断 ct值为≤39，内参基因阳性判断ct 值为≤38。

6.一种如权利要求1至5任意一项所述布鲁氏菌dna荧光pcr检测试剂盒的用途。

技术总结本发明公开了一种布鲁氏菌DNA荧光PCR检测试剂盒，本发明提供用于布鲁氏菌DNA检测的特异性引物和探针，并建立了应用荧光定量聚合酶链反应（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qPCR）对待检样本中布鲁氏菌特异性DNA进行检测的布鲁氏菌DNA荧光qPCR检测方法。本发明的特异性引物探针和检测方法特异性强、灵敏度高、具有良好重复性和稳定性，为布鲁氏菌的感染诊断和鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。技术研发人员：季绍有,万康林,马立东,朱留伟,王丹青受保护的技术使用者：浙江元勤生物医药科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/9