一种有机污染土壤固碳消污功能菌群的制备方法

本发明涉及土壤微生物修复，具体是涉及一种有机污染土壤固碳消污功能菌群的制备方法。

背景技术：

1、多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons， pahs）是一类含有多个苯环的难降解有机污染物，具有遗传毒性、突变性和致癌性。自然环境中的pahs主要来源于焦化、炼油、煤炭燃烧以及秸秆和柴火燃烧。土壤是环境中pahs的主要富集场所之一，进入土壤的pahs可被有机质吸附，难以消除，从而导致土壤污染。农田是农业生产的主体，而农田土壤pahs污染问题会威胁农产品质量和人群健康。因此，农田土壤中pahs污染问题应引起足够重视。

2、土壤是陆地上最大的碳库，25%的潜在全球气候问题是由土壤碳引起。因此，土壤对于减少碳排放和增加碳汇非常重要，在减缓气候变化方面具有可靠的生态功能。

3、如何高效处理土壤中pahs仍是亟需解决的关键问题。通过微生物进行生物降解可以将有害的有机污染物分解为无毒或低毒产物，具有安全、经济及应用方便等特点。同时，土壤中的微生物在土壤有机碳的形成和保持有机碳的持久性中也起到关键作用。目前，已有不少国内外专家筛选出具有pahs降解功能的菌株，但可以同时实现土壤中菲降解和co2固定的微生物功能菌群制备技术鲜有报道。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种有机污染土壤固碳消污功能菌群的制备方法，包括以下步骤：

2、s1、第一菌种培养：取sphingobium sp.rs2菌种使用lb培养基进行活化培养，得到sphingobium sp.rs2单菌待用；

3、s2、第二菌种培养：取nitrososphaera viennensis.en76菌种在恒温培养箱中持续避光培养，得到nitrososphaera viennensis.en76单菌待用；

4、s3、细胞数定量：使用单拷贝基因nahe对s1所制备的sphingobium sp.rs2单菌中的细胞数进行定量，使用单拷贝基因amoa对s2所制备的nitrososphaera viennensis.en76单菌中的细胞数进行定量；

5、s4、单菌混合：将所述sphingobium sp.rs2单菌和所述nitrososphaeraviennensis.en76单菌按细胞数1:1的比例混合，细胞数取108，得到功能菌群。

6、进一步地，所述s1中，活化培养的方法为：将一接种环sphingobium sp.rs2菌种加入到20~30mllb培养基中，将sphingobium sp.rs2菌种培养至对数生长期，进行离心处理，去掉上清液，得到sphingobium sp.rs2沉淀，向所述sphingobium sp.rs2沉淀中加入无机盐培养基进行重悬处理，重复上述离心处理和重悬处理的步骤2~3次，最后一次重悬后得到所述sphingobium sp.rs2单菌。

7、更进一步地，所述将sphingobium sp.rs2菌种培养至对数生长期的培养条件为：温度为28~32℃，在120~160rpm的转速下振荡培养10~15h。

8、更进一步地，所述离心处理的条件为：温度为3~5℃，在7500~8500rpm的转速下离心4~6min。

9、进一步地，所述s2中，恒温培养箱的温度为40~43℃，所述持续避光培养过程中，每次培养至对数生长期，得到所述nitrososphaera viennensis.en76单菌。

10、进一步地，所述s3中，对s1所制备的sphingobium sp.rs2单菌中的细胞数进行定量的方法为：

11、基于单拷贝基因nahe的基因序列设计引物，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如seq id no.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，

12、seq id no.1：ttggcgtgccgatgtggtg

13、seq id no.2：gcgggaaatcgaatttgaagg

14、将所述引物进行pcr扩增，得到基因序列，并将所述基因序列导入质粒，构建得到标准质粒，再将所述标准质粒进行10倍梯度稀释，得到模板dna，然后进行荧光定量pcr，获得标准曲线，然后使用dna提取试剂盒提取1ml sphingobium:sp.rs2单菌的dna，进行荧光定量pcr，获得ct值，根据ct值计算拷贝数，单拷贝基因的拷贝数代表每微升细胞数。

15、更进一步地，所述荧光定量pcr的反应体系如下：

16、 试剂 体积 ace qpcr sybr green master mix 10 μl 正向引物 0.4 μl 反向引物 0.4 μl 模板dna 1 μl <![cdata[ddh₂o]]> 8.2 μl

17、所述荧光定量pcr的程序条件为：将所述模板dna在95℃下进行预变性加热，保持5min，随后继续在95℃下进行变性加热10s，退火30s，退火温度为56℃，延伸30s，延伸温度72℃，共完成40个循环，进行溶解曲线分析，分析条件为95℃下加热15s，降温至60℃加热1min，升温至95℃保持1s。

18、进一步地，所述s3中，对s2所制备的nitrososphaera viennensis.en76单菌中的细胞数进行定量的方法为：

19、基于单拷贝基因amoa的基因序列设计引物，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如seq id no.3所示，反向引物的序列如seq id no.4所示，

20、seq id no.3：tcggtctcggatacttgaa

21、seq id no.4：gcacgctgtcatcatcat

22、将所述引物进行pcr扩增，得到基因序列，并将所述基因序列导入质粒，构建得到标准质粒，再将所述标准质粒进行10倍梯度稀释，得到模板dna，然后进行荧光定量pcr，获得标准曲线，然后使用dna提取试剂盒提取1ml nitrososphaera viennensis.en76单菌的dna，进行荧光定量pcr，获得ct值，根据ct值计算拷贝数，单拷贝基因的拷贝数代表每微升细胞数。

23、更进一步地，所述荧光定量pcr的反应体系如下：

24、 试剂 体积 ace qpcr sybr green master mix 10 μl 正向引物 0.4 μl 反向引物 0.4 μl 模板dna 1 μl <![cdata[ddh₂o]]> 8.2 μl

25、所述荧光定量pcr的程序条件为：将所述模板dna在95℃下进行预变性加热，保持5min，随后继续在95℃下进行变性加热10s，退火30s，退火温度为60℃，延伸30s，延伸温度72℃，共完成40个循环，进行溶解曲线分析，分析条件为95℃下加热15s，降温至60℃加热1min，升温至95℃保持1s。

26、优选地，还包括：通过琼脂糖凝胶电泳验证所设计的引物的可行性。

27、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

28、（1）本发明的一种有机污染土壤固碳消污功能菌群的制备方法中，菌种培养简单，复配难度低，易操作，不仅可以修复菲污染农田土壤，降低其对农产品安全的威胁，又可以固定co2，增加农田土壤中soc含量。

29、（2）通过采用本发明的方法制备得到的功能菌群修复pahs污染农田土壤可以为农田土壤固碳消污提供技术支持和理论支撑。