一种用于核酸检测的CRISPR介导的单管一步法检测方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于核酸检测的crispr介导的单管一步法检测方法。

背景技术：

1、crispr/cas技术，尤其与恒温扩增技术结合时，在分子诊断和生物传感方面具有超灵敏、高特异和易于操作的优势。目前有部分研究已经将crispr/cas诊断技术用于多种病原体的检测，包括基于crispr/cas12a的detectr平台用于检测人类乳头瘤病毒（hpv），基于crispr/cas12a的mccd平台用于诊断新型冠状病毒感染（covid-19），以及基于crispr/cas13a的sherlock平台用于检测登革热病毒（denv）、寨卡病毒（zikv）和人类乳头瘤病毒（hpv）等。

2、遗憾的是，现有的crispr/cas诊断技术通常分为两步：首先利用pcr技术或恒温扩增技术对靶标预扩增，然后利用crispr/cas系统检测扩增信号。这种两步法的技术容易导致交叉污染，同时也使检测程序复杂化。此外，crispr系统介导的信号检测的效率取决于cas效应蛋白对单链dna（ssdna）或rna（ssrna）的非特异性剪切能力，因此需要在靶序列附近存在特定的pam。所以，常规的crispr检测技术无法对缺乏pam序列的靶标进行检测。因此，目前迫切需要一种能够将pam序列整合到外部引物中、有效地扩增目标序列、并在单个反应容器内与crispr/cas检测无缝集成的新型技术，预期这种技术将具有很高的应用价值。

3、自2023年5月以来，儿童呼吸道疾病病例激增，这波引人注目的儿童肺炎主要归因于肺炎支原体（ mycoplasma pneumoniae, m. pneumoniae）的延迟复发。肺炎支原体是引起儿童呼吸道感染尤其是社区获得性肺炎的常见病原体，这是一种非典型病原体，是最小的能够自我复制的原核生物，缺乏细胞壁且生长缓慢。虽然肺炎支原体引起的感染通常较轻，很少需要住院治疗，但由于对大环内酯类药物的耐药率极高，最近暴发的肺炎支原体感染在儿童中尤为严重。因此，迫切需要有效的管理策略，包括加强疾病监测系统、改进诊断检测和预防措施，这对于遏制肺炎支原体诱发感染的传播和减少感染的影响和严重程度至关重要。

4、目前，可用于肺炎支原体检测的诊断方法包括细菌培养、分子诊断技术以及血清学检测。其中，血清学检测和实时聚合酶链反应（rt-pcr）法应用最广泛，在肺炎支原体检测中发挥了重要作用。然而，这些方法存在一些局限性，包括灵敏度有限，严重依赖昂贵的设备和专业技术人员，这些因素可能会影响肺炎支原体检测的准确性和可及性。因此，迫切需要开发更加精确和操作简便的肺炎支原体检测方法，以提高现有的检测效力。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种新的crispr/cas检测技术。

2、为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、具体地，第一方面，本发明提供了一种非诊断目的的基于crispr的单管一步法检测靶序列的方法，其包括：

4、（1）将待测样本的dna模版、mcda引物、dna聚合酶、apacas12b-grna复合物、荧光探针混合，得到反应体系；

5、（2）在恒定温度下，将（1）中反应体系进行mcda介导的等温扩增、基于crispr/cas12b的反式切割反应；

6、所述的mcda引物包括置换引物、扩增引物、交叉引物，所述的交叉引物包含pam位点，apacas12b-grna复合物中grna与靶序列互补，所述的荧光探针为ssdna探针。

7、在本发明中，所述的交叉引物包含两条引物，所述的交叉引物包含pam位点是指交叉引物中的一条引物包含pam位点。

8、在本发明中，所述的待测样本为临床样本。所述的临床样本包括但不限于鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液。

9、根据本发明的具体实施方式，所述的方法还包括获得待测样本的dna模版。

10、在本发明中，apacas12b-grna 复合物的制备方法为：将grna与aapcas12b混合均匀，然后用aapcas12b和双蒸水调整至固定体积，在37℃下孵育10分钟后使用。制备好的cas12b-grna复合物应立即使用或在4℃下储存不超过12h。

11、在一些实施方式中，所述的pam位点为ttc。

12、在一些实施方式中，所述的荧光探针的两端修饰有荧光基团、荧光猝灭基团。

13、在本发明中，所述的荧光基团包括hex、joe、tet、rox、tam或fam中的任意一种；所述的荧光猝灭基团包括bhq1、bhq2或mgb中的任意一种。

14、根据本发明的具体实施方式，所述的荧光基团为fam，所述的荧光猝灭基团为bhq1。

15、在一些实施方式中，所述的置换引物包括f1和f2，所述的扩增引物包括c1，d1，r1，c2，d2和r2，所述的交叉引物包括cp1*和cp2；所述的f1的序列如seq id no.1所示，所述的f2的序列如seq id no.2所示，所述的c1的序列如seq id no.6所示，所述的d1的序列如seqid no.7所示，r1的序列如seq id no.8所示，所述的c2的序列如seq id no.9所示，所述的d2的序列如seq id no.10所示，所述的r2的序列如seq id no.11所示，所述的cp1*的序列如seq id no.4所示，所述的cp2的序列如seq id no.5所示；所述的apacas12b-grna复合物中的grna的序列如seq id no.12所示；所述的荧光探针的序列如seq id no.13所示。

16、在一些实施方式中，所述的恒定温度为56℃至61℃。

17、作为一种优选的实施方式，所述的恒定温度为60℃。

18、在一些实施方式中，在所述的反应体系中，所述的mcda引物的终浓度为：每条置换引物0.18 μm，每条扩增引物0.36 μm，每条交叉引物0.72 μm。

19、在一些实施方式中，所述的方法还包括使用荧光仪器检测步骤（2）中反式切割反应产生的荧光信号。

20、第二方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括：mcda引物、dna聚合酶、apacas12b-grna复合物、荧光探针，所述的mcda引物包括置换引物、扩增引物、交叉引物，所述的交叉引物包含pam位点，apacas12b-grna复合物中grna与靶序列互补，所述的荧光探针为ssdna探针。

21、在一些实施方式中，所述的置换引物包括f1和f2，所述的扩增引物包括c1，d1，r1，c2，d2和r2，所述的交叉引物包括cp1*和cp2，其中，所述f1的序列如seq id no.1所示，所述的f2的序列如seq id no.2所示，所述的c1的序列如seq id no.6所示，所述的d1的序列如seq id no.7所示，r1的序列如seq id no.8所示，所述的c2的序列如seq id no.9所示，所述的d2的序列如seq id no.10所示，所述的r2的序列如seq id no.11所示，所述的cp1*的序列如seq id no.4所示，所述的cp2的序列如seq id no.5所示；所述的apacas12b-grna复合物中的grna的序列如seq id no.12所示；所述的荧光探针的序列如seq id no.13所示。

22、第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的试剂盒在制备检测肺炎支原体的产品中的应用。

23、在一些实施方式中，所述的产品包括试剂盒、检测装置。

24、有益效果

25、本发明首次公开了一种基于crispr的新型检测系统，称为crispr-one（crispr介导的单管一步法检测），它将多重交叉置换扩增（multiple cross displacementamplification，mcda）与crispr/cas12b系统集成在一起。crispr-one检测平台能够在恒定温度下、单个反应管内进行靶标预扩增和crispr介导的信号检测。crispr-one检测的结果可以使用实时荧光仪器直接可视化读取。值得注意的是，crispr-one检测平台可以检测本身缺乏pam位点的靶基因，因为该检测平台中使用的工程引物被修改为包含pam位点（图1）。