一种利用生物发酵生产L-组氨酸的工艺的制作方法

本发明属于生物发酵，具体地，涉及一种利用生物发酵生产l-组氨酸的工艺。

背景技术：

1、l-组氨酸（l-histidine）化学名α-氨基β-咪唑基丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸。l-组氨酸是人体的一种半必需氨基酸,广泛应用于医药、食品和饲料行业,还用于烟草制品和化妆品的生产中。l-组氨酸的生产以蛋白质水解法为主,但此法存在操作步骤繁琐、环境污染大、生产成本高等问题。近年来，微生物发酵法已成功应用于多种氨基酸的工业生产中,具有发酵周期短、成本低、作用条件温和、过程易控制和产率高等优点,也是工业化生产l-组氨酸的首选方法。采用微生物发酵法生产l-组氨酸具有广阔的前景，而且其产率还有很大的提高空间。

2、现有技术对组氨酸生物发酵研究主要包括：筛选菌株、优化培养工艺以及添加刺激因子等因素。

3、文献1：生物技术2008年，赵建云等，发现在发酵培养基中添加葡萄糖酸钙能够增加hmp途径的通量，有利于谷氨酸棒杆菌clw0911中组氨酸的合成。

4、文献2：微生物技术通讯2009年，朱文泽等，提供了一种提高l-组氨酸发酵过程产率的方法，根据调整细胞代谢流分配的原理，采用在培养基中添加柠檬酸或其盐的方法，来有效提高谷氨酸棒杆菌tl1105中l-组氨酸发酵的产率。

5、文献3：cn112481325a，不同菌株的产酸机制以及对刺激因子的耐受程度差异较大，但是并不具备借鉴意义，尽管现有技术对谷氨酸的产酸机制作了较多研究，例如在发酵培养基中添加适量的苹果酸钠能够提高谷氨酸棒杆菌产组氨酸的量，但是苹果酸钠对粘质沙雷氏菌atcc31026并无明显刺激效果；而通过流加乙酸钙和丙二酸对粘质沙雷氏菌产组氨酸的能力明显提高。

6、原核生物细胞能量和物质代谢的途径是一个很复杂的网络, 改变代谢途径中的基因会对能量和物质流产生怎样的影响, 仍然不是很清楚。由于不同的菌株的代谢通路也存在较大差异，针对不同的发酵菌株，需要通过实验手段进行测试，如何提高特定菌株的发酵性能是需要解决的技术问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种利用生物发酵生产l-组氨酸的工艺，该工艺发酵效率高，生产成本低，适合大规模工业化生产。

2、包括组氨酸、色氨酸、缬氨酸以及苯丙氨酸在内的芳香族或杂环族氨基酸均与hmp途径相关，途径中的赤藓糖-4-磷酸是合成芳香族、杂环族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸）的关键原料。大肠埃希氏菌（escherichia coli）tr2023d-1的产色氨酸能力较出发菌株大幅增加，说明hmp途径的代谢流增加，与hmp途径相关的其他氨基酸（包括组氨酸）的合成能力也极有可能上调，而该菌株属于苯丙氨酸、酪氨酸缺陷型菌株，无需对苯丙氨酸和酪氨酸的合成进行调控。

3、基于上述理论，研究和优化产色氨酸的大肠埃希氏菌（escherichia coli）tr2023d-1的产组氨酸性能，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.27549（cn117778225a，已保藏）。

4、本发明是通过如下技术方案来实现的。

5、一种利用生物发酵生产l-组氨酸的工艺，其包括如下步骤：

6、将大肠埃希氏菌种子液接入含有发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-37℃，通过流加含有一磷酸腺苷的葡萄糖溶液的维持还原糖含量为4-6g/l，发酵结束前4h停止流加葡萄糖溶液；通过流加氨水维持发酵罐内ph在6.9-7.1，流加消泡剂消泡；发酵时间为40-50h，即得l-组氨酸发酵液；

7、所述发酵培养基组分为：葡萄糖50-80g/l、玉米浆5-20g/l、硫酸铵5-10g/l、磷酸二氢钾4-6g/l、柠檬酸1-3g/l、七水硫酸镁1-2g/l、苹果酸钠0.2-0.5g/l、七水硫酸亚铁50-200mg/l、吲哚丙酸5-20mg/l、硫胺素0.4-0.6mg/l、生物素0.1-0.3mg/l。

8、作为优选的实施方式，所述发酵培养基组分为：葡萄糖60g/l、玉米浆10g/l、硫酸铵8g/l、磷酸二氢钾5g/l、柠檬酸2g/l、七水硫酸镁1.5g/l、苹果酸钠0.4g/l、七水硫酸亚铁100mg/l、吲哚丙酸10mg/l、硫胺素0.5mg/l、生物素0.2mg/l；ph控制在7.0。

9、作为优选的实施方式，所述发酵培养基组分为：葡萄糖60g/l、玉米浆10g/l、硫酸铵8g/l、磷酸二氢钾5g/l、柠檬酸2g/l、七水硫酸镁1.5g/l、苹果酸钠0.3g/l、七水硫酸亚铁100mg/l、吲哚丙酸15mg/l、硫胺素0.5mg/l、生物素0.2mg/l；ph控制在7.0。

10、作为优选的实施方式，所述葡萄糖溶液的组分为：葡萄糖500g/l+一磷酸腺苷15g/l。

11、作为优选的实施方式，所述葡萄糖溶液的组分为：葡萄糖600g/l+一磷酸腺苷20g/l。

12、作为优选的实施方式，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌tr2023d-1。

13、作为优选的实施方式，所述大肠埃希氏菌种子液的接种量为5-10%。

14、作为优选的实施方式，所述发酵时间为48h。

15、作为优选的实施方式，所述还原糖含量为5g/l。

16、作为优选的实施方式，所述发酵温度为36℃。

17、本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

18、代谢网络是一个十分复杂的多酶同步催化反应体系，仅仅改变其中的一步限速反应，对产物合成的影响往往可能不会很大，因此要优化某一代谢网络，必须同时调节对产物有影响的主要节点，使代谢流量重新获得分配，以利于目的产物的积累。本发明通过对发酵培养基以及刺激因子等条件的优化，将产色氨酸的大肠埃希氏菌tr2023d-1的产组氨酸性能大幅提升，相应地弱化了hmp途径中色氨酸的合成效率。苹果酸盐可以抑制丙酮酸激酶的活性，减少丙酮酸的积累，造成磷酸烯醇式丙酮酸的积累，磷酸烯醇式丙酮酸是emp途径限速酶磷酸果糖激酶的抑制剂，所以磷酸烯醇式丙酮酸的积累降低了磷酸果糖激酶的活性，从而降低了emp途径的通量，缓解了emp和tca之间的代谢溢流。同时，葡萄糖总通量没有变化，所以更多的葡萄糖进入hmp合成途径，相应的提高了l-组氨酸的产率。邻氨基苯甲酸合成酶是色氨酸合成中的主要关键酶，吲哚丙酸作为邻氨基苯甲酸合成酶的变构抑制剂，通过弱化酶的活性，减少hmp途径中色氨酸的合成代谢流量来增加组氨酸合成方向的代谢流。 一磷酸腺苷（amp）是 atp 合成的直接前体,其可能通过合成atp或激活组氨酸合成中的关键酶来提高组氨酸的合成效率。

技术特征：

1.一种利用生物发酵生产l-组氨酸的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基组分为：葡萄糖60g/l、玉米浆10g/l、硫酸铵8g/l、磷酸二氢钾5g/l、柠檬酸2g/l、七水硫酸镁1.5g/l、苹果酸钠0.4g/l、七水硫酸亚铁100mg/l、吲哚丙酸10mg/l、硫胺素0.5mg/l、生物素0.2mg/l；ph控制在7.0。

3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基组分为：葡萄糖60g/l、玉米浆10g/l、硫酸铵8g/l、磷酸二氢钾5g/l、柠檬酸2g/l、七水硫酸镁1.5g/l、苹果酸钠0.3g/l、七水硫酸亚铁100mg/l、吲哚丙酸15mg/l、硫胺素0.5mg/l、生物素0.2mg/l；ph控制在7.0。

4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述葡萄糖溶液的组分为：葡萄糖500g/l+一磷酸腺苷15g/l。

5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述葡萄糖溶液的组分为：葡萄糖600g/l+一磷酸腺苷20g/l。

6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述大肠埃希氏菌为大肠埃希氏菌tr2023d-1。

7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述大肠埃希氏菌种子液的接种量为5-10%。

8.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵时间为48h。

9.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述还原糖含量为5g/l。

10.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵温度为36℃。

技术总结本发明属于生物发酵技术领域，公开了一种利用生物发酵生产L‑组氨酸的工艺，其包括如下步骤：将大肠埃希氏菌种子液接入含有发酵培养基的发酵罐中，培养温度35‑37℃，通过流加含有一磷酸腺苷的葡萄糖溶液维持还原糖含量为4‑6g/L，发酵结束前4h停止流加葡萄糖溶液；通过流加氨水维持发酵罐内pH在6.9‑7.1，流加消泡剂消泡；发酵时间为40‑50h，得L‑组氨酸发酵液。本发明工艺发酵效率高，生产成本低，适合工业化生产。技术研发人员：冯世红,聂其凯,聂桂彬受保护的技术使用者：内蒙古阜丰生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/12