非侵入性产前样本制备以及相关方法和用途与流程

本文描述了从妊妇制备样本的方法，以及分析此类样本的相关方法。

背景技术：

1、以下对本技术背景的描述仅是为了帮助理解本技术而提供，并不承认描述或构成本技术的现有技术。

2、非侵入性产前筛查(non-invasive pre-natal screening；nips)已经成为妊妇保健的一常规组成部分。nips可涉及筛查非整倍体(如唐氏综合征(down syndrome)等)和筛查母亲或胎儿的其它基因异常。许多此类筛查利用游离dna(cfdna)；然而，cfdna的利用遇到许多挑战，因为母体血浆中仅一小部分cfdna来自胎儿。

3、另外，对某些遗传性病况的产前筛查传统上需要从母亲和父亲二者获得dna样本。举例来说，检测非整倍体和各种基因状况的传统方法需要从胎儿的母亲和父亲二者获得基因组dna(gdna)样本，以及从母亲获得cfdna。因此，这种测试需要至少三个样本，每个样本可以不同方式进行处理和评估。

4、本公开通过提供选择性地使母体样本的胎儿部分富集的方法来解决那些挑战，使得非整倍体和其它基因变体/突变二者的nips可以仅用单一母体样本并行进行。

技术实现思路

1、本公开总体上是涉及新的样本制备和对来自单一样本的非整倍体和其它基因变异(如致病性snp、插入或缺失(indel)和单基因拷贝数变异(single gene copy numbervariation))的并行筛查。这些组合物和方法通过对所需分析进行流线型化和简化、使用更少样本及降低背景噪声来改善非侵入性产前筛查(nips)，与常规产前筛查分析相比，所有所述方法皆具有更低的复杂性且需要更少的时间。

2、在一个方面中，本公开提供了制备具有经富集的胎儿部分的生物样本的方法，其包括：

3、(a-1)从孕妇获得包括游离dna(cfdna)的生物样本；

4、(b-1)从所述生物样本中萃取cfdna；

5、(c-1)制备cfdna片段库以获得cfdna库；

6、(d-1)根据大小分离所述cfdna库中的所述cfdna片段，以仅保留小于约150个核苷酸长度、约155个核苷酸长度、约160个核苷酸长度、约165个核苷酸长度、约170个核苷酸长度、约175个核苷酸长度、约180个核苷酸长度、约185个核苷酸长度、约190个核苷酸长度、约195个核苷酸长度、或约200个核苷酸长度的cfdna片段；

7、(e-1)对所保留的cfdna片段进行测序以获得第一序列库；

8、(f-1)基于读段长度的长度鉴定存在于所述第一序列库的至少两个窗口中的(i)游离胎儿dna(cffdna)序列和(ii)游离母体dna(cfmdna)序列；及

9、(g-1)从所述序列库的所述至少两个窗口中的每一个中分离所述cffdna序列，从而获得至少两个富集胎儿部分的序列库；

10、或者

11、(a-2)从孕妇获得包括游离dna(cfdna)的生物样本；

12、(b-2)从所述生物样本中萃取cfdna；

13、(c-2)分离来自(b-2)的所萃取的样本中的cfdna片段，以仅保留小于约150个核苷酸长度、约155个核苷酸长度、约160个核苷酸长度、约165个核苷酸长度、约170个核苷酸长度、约175个核苷酸长度、约180个核苷酸长度、约185个核苷酸长度、约190个核苷酸长度、约195个核苷酸长度、或约200个核苷酸长度的cfdna片段；

14、(d-2)从来自(c-2)的所分离的cfdna片段制备cfdna库；

15、(e-2)对所述cfdna库进行测序以获得第一序列库；

16、(f-2)基于读段长度的长度鉴定存在于所述第一序列库的至少两个窗口中的(i)游离胎儿dna(cffdna)序列和(ii)游离母体dna(cfmdna)序列；及

17、(g-2)从所述序列库的所述至少两个窗口中的每一个中分离所述cffdna序列，从而获得至少两个富集胎儿部分的序列库。

18、在一些实施例中，分离所述cfdna片段使所述生物样本中的胎儿部分富集约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、或约2.0倍。

19、在一些实施例中，从所述第一序列库的所述至少两个窗口中分离所述cffdna序列使所述生物样本中的胎儿部分富集约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2.0倍、约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约2.6倍、约2.7倍、约2.8倍、约2.9倍、约3.0倍、约3.1倍、约3.2倍、约3.3倍、约3.4倍、或约3.5倍。

20、在一些实施例中，分离所述cfdna片段包括电泳。

21、在一些实施例中，评估所述第一序列库的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个窗口，以鉴定和分离cffdna序列，从而分别获得至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个富集胎儿部分的序列库。

22、在一些实施例中，所述方法可进一步包括通过对所述第一序列库中的cffdna和cfmdna的序列读段与参考基因组进行比较、对来自所述第一库的序列读段进行解多工、从所述第一序列库中去除重复序列、或其组合，从而从cfmdna中鉴定和分离cffdna。

23、在一些实施例中，所述方法可进一步包括评估所述至少两个富集胎儿部分的序列库中一种或多种基因突变的存在。在一些实施例中，所述一种或多种基因突变导致选自以下的至少一种病况：21-羟化酶缺乏症、abcc8相关高胰岛素症、arsacs、软骨发育不全、全色盲、腺苷单磷酸脱胺酶1、胼胝体发育不全伴神经元病、黑尿症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、α-甘露糖储积症、α-肌聚糖病、α-地中海贫血；阿尔茨海默症(alzheimers)，血管收缩素ii受体i型、脂蛋白e基因分型；精胺琥珀酸尿症(argininosuccinicaciduria)、天门冬葡萄糖胺尿、运动失调伴维生素e缺乏、运动失调毛细管扩张症、自体免疫多内分泌病变综合征1型、brca1遗传性乳腺癌/卵巢癌、brca2遗传性乳腺癌/卵巢癌、bardet-biedl二氏综合征、best卵黄囊状黄斑失养症、β-肌聚糖病、β-地中海贫血、生物素酶缺乏症、blau综合征、bloom综合征、cftr相关病症、cln3相关神经性类蜡脂褐质病、cln5相关神经性类蜡脂褐质病、cln8相关神经性类蜡脂褐质病、canavan病、肉毒碱棕榈酰转移酶ia缺乏症、肉毒碱棕榈酰转移酶ii缺乏症、软骨-毛发发育不良、脑海绵状畸形(cerebral cavernous malformation)、无脉络脉畸型、cohen氏综合征、先天性白内障、面部异形(facial dysmorphism)及神经病变、先天性糖基化障碍la(congenital disorder of glycosylationla)、先天性糖基化障碍ib、先天性芬兰肾病(congenital finnish nephrosis)、克隆氏病(crohn disease)、胱氨酸病、dfna 9(coch)、糖尿病及听力损失、早发性原发性肌紧张不足(early-onset primarydystonia；dyti)、herlitz-pearson型交界型水疱性表皮松解症(epidermolysis bullosajunctional,herlitz-pearson type)、fancc相关fanconi贫血、fgfr1相关颅缝线封闭过早、fgfr2相关颅缝线封闭过早、fgfr3相关颅缝线封闭过早、第五因素leiden血栓好发症(factor vleiden thrombophilia)、第五因素r2突变血栓好发症、第十一因素缺乏症、第十三因素缺乏症、家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis)、家族性自主神经障碍(familial dysautonomia)、家族性高胆固醇血症b型、家族性地中海热(familialmediterranean fever)、游离唾液酸存储障碍(free sialic acid storage disorder)、额颞叶痴呆伴帕金森氏症17(frontotemporal dementia with parkinsonism-17)、延胡索酸酶缺乏症、gjb2相关dfna 3型非综合征性听力损失及耳聋、gjb2相关dfnb 1非综合征性听力损失及耳聋、gne相关肌病、半乳糖血症、gaucher氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、戊二酸血症1型、糖原贮积病1a型(glycogen storage disease type 1a)、糖原贮积病ib型、糖原贮积病ii型、糖原贮积病iii型、糖原贮积病v型、gracile综合征、hfe相关联的遗传性血铁沉积症(hfe-associated hereditary hemochromatosis)、halder aims、血红蛋白sβ-地中海贫血、遗传性果糖不耐受、遗传性胰腺炎、遗传性胸腺嘧啶-尿嘧啶尿症(hereditarythymine-uraciluria)、己糖胺酶a缺乏症、有汗性外胚层发育异常2(hidrotic ectodermaldysplasia 2)、胱硫醚β-合酶缺乏引起的高胱氨酸尿症、高钾血周期性麻痹1型、高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿综合征、原发性高草酸盐尿症1型、原发性高草酸盐尿症2型、软骨生成减退、低钾血周期性麻痹1型、低钾血周期性麻痹2型、低磷酸酶症、婴儿肌病及乳酸性酸中毒(致死型和非致死型)、异戊酸血症、krabbe病、lgmd2i、leber遗传性视神经病变、法国-加拿大型leigh综合征、长链3-羟酰基-辅酶a脱氢酶缺乏症(long chain 3-hydroxyacyl-coa dehydrogenase deficiency)、melas、merrf、mthfr缺乏症、mthfr不耐热变异、mtrnr1相关听力损失及耳聋、mtts1相关听力损失及耳聋、myh相关联的息肉病、枫糖浆尿病1a型、枫糖浆尿病1b型、马科恩-亚百特氏综合征(mccune-albright syndrome)、中链酰基辅酶a脱氢酶缺乏症、巨脑白质病伴皮质下囊肿(megalencephalicleukoencephalopathy with subcortical cyst)、异染性白质失养症(metachromaticleukodystrophy)、线粒体心肌病(mitochondrial cardiomyopathy)、线粒体dna相关联的leigh综合征及narp、黏脂贮积病iv(mucolipidosis iv)、黏多糖病i型(mucopolysaccharidosis type i)、黏多糖病iiia型、黏多糖病vii型、多发性内分泌瘤2型、肌-眼-脑疾病、线样肌病(nemaline myopathy)、神经表型、由于神经磷脂酶缺乏引起的尼曼-匹克病(niemann-pick disease due to sphingomyelinase deficiency)、尼曼-匹克病c1型、奈梅亨染色体断裂综合征(nijmegen breakage syndrome)、ppt1相关神经性类蜡脂褐质病、prop1相关下垂体激素缺乏症(prop1-related pituitary hormonedeficiency)、pallister-hall综合征、先天性肌刚痉病(paramyotonia congenita)、pendred综合征、过氧化体双功能酶缺乏症、广泛性发展障碍(pervasive developmentaldisorder)、苯丙氨酸羟化酶缺乏症、血浆蛋白原活化因子抑制物i(plasminogenactivator inhibitor i)、常染色体隐性遗传多囊肾病、凝血酶原g20210a血栓好发症、假维生素d缺乏性佝偻病、致密成骨不全症、bothnia型常染色体隐性色素沉着性视网膜炎、雷特氏综合征(rett syndrome)、肢根性点状软骨发育异常1型(rhizomelicchondrodysplasia punctata type 1)、短链酰基辅酶a脱氢酶缺乏症、shwachman-diamond综合征、sjogren-larsson综合征、smith-lemli-opitz综合征、痉挛性截瘫13、硫酸盐转运蛋白相关骨软骨发育不良、tfr2相关遗传性血色病、tpp1相关神经性类蜡脂褐质病、致死性软骨发育不全、运甲状腺素蛋白淀粉样变性(transthyretin amyloidosis)、三功能蛋白缺乏症、酪氨酸羟化酶缺乏性drd、酪氨酸血症i型、wilson氏病、x性联青年性视网膜劈裂症(x-linked juvenile retinoschisis)、囊肿纤维化(cystic fibrosis)、脊髓性肌肉萎缩症(sma)、血红素病、和zellweger综合征谱系。

24、在一些实施例中，所述方法可进一步包括评估包括cfdna的生物样本中非整倍体的存在。在一些实施例中，所述非整倍体选自单染色体、三染色体、四染色体、五染色体、微缺失、微复制、以及单染色体、三染色体、四染色体、和五染色体的嵌合体形式。

25、在另一方面中，本公开提供了并行检测单一母体样本中非整倍体的存在或不存在以及至少一种基因变体的存在或不存在的方法，其包括

26、(i)从孕妇获得生物样本，其中所述生物样本包括游离dna(cfdna)；

27、(ii)制备cfdna库；

28、(iii)对所述cfdna库进行测序以产生序列库；及

29、(iv)检测所述单一母体样本中非整倍体的存在或不存在以及至少一种基因变体的存在或不存在；

30、其中(a)使所述cfdna库富集以增加胎儿部分，(b)使所述序列库富集以增加胎儿部分，或(c)其组合，使得在检测所述单一母体样本中非整倍体的存在或不存在以及至少一种基因变体的存在或不存在之前，所述单一母体样本的所述胎儿部分增加至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、或至少1.5倍。

31、在一些实施例中，所述生物样本是血液、血清、或血浆。

32、在一些实施例中，使所述cfdna库富集以增加胎儿部分，并且使所述序列库富集以增加胎儿部分。

33、在一些实施例中，富集所述cfdna库的胎儿部分包括从所述cfdna库中去除大于约150个核苷酸长度、约155个核苷酸长度、约160个核苷酸长度、约165个核苷酸长度、约170个核苷酸长度、约175个核苷酸长度、或约180个核苷酸长度的任何dna片段。在一些实施例中，从所述cfdna库中去除所述dna片段包括电泳。

34、在一些实施例中，富集所述序列库的胎儿部分包括对所述序列库的至少两个窗口中的序列进行基于读段长度的大小排除，从而获得至少两个富集胎儿部分的序列库。在一些实施例中，评估所述第一序列库的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个窗口，以鉴定和分离cffdna序列，从而分别获得至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个富集胎儿部分的序列库。在一些实施例中，所述序列库的至少两个窗口选自(i)0-145个核苷酸的序列、(ii)0-150个核苷酸的序列、(iii)0-155个核苷酸、(iv)0-160个核苷酸、(v)0-165个核苷酸、(vi)0-168个核苷酸、(vii)0-170个核苷酸、(viii)0-175个核苷酸、(ix)0-180个核苷酸、(x)0-185个核苷酸、(xi)0-190个核苷酸、(xii)0-195个核苷酸、(xiii)0-200个核苷酸、和(xiv)未闸控者。

35、在一些实施例中，富集所述序列库的胎儿部分进一步包括通过对所述第一序列库中的cffdna和cfmdna的序列读段与参考基因组进行比较、对来自所述第一库的序列读段进行解多工、从所述第一序列库中去除重复序列、或其组合，从而从cfmdna中鉴定和分离cffdna。

36、在一些实施例中，检测至少一种基因变体的存在或不存在包括在所述至少两个富集胎儿部分的序列库中的每一个中确定样本中编码所述至少一种基因变体的每个等位基因的等位基因平衡，并基于所述至少两个富集胎儿部分的序列库中的每一个中的所述等位基因平衡产生每个等位基因的等位基因平衡轨迹，基于所述至少两个富集胎儿部分的序列库的深度产生深度轨迹，或产生等位基因平衡轨迹和深度轨迹的组合。

37、在一些实施例中，检测非整倍体的存在或不存在包括分析所述序列库中对应于感兴趣的染色体的至少一个序列的序列深度。在一些实施例中，对应于所述感兴趣的染色体的所述至少一个序列的所述序列深度适配所述感兴趣的染色体的预期深度模型。在一些实施例中，所述序列深度通过下式来计算：

38、

39、其中：

40、dp是妊娠深度

41、f是胎儿部分

42、cm是母体拷贝数

43、db是背景深度

44、cf是胎儿拷贝数。

45、在一些实施例中，将所述序列深度正规化以控制gc偏差、样本背景、杂交探针捕获、或其组合。

46、在一些实施例中，所述方法包括检测选自单染色体、三染色体、四染色体、多染色体x、多染色体y、微缺失、微重复、五染色体、及其组合的非整倍体的存在或不存在。

47、在一些实施例中，所述至少一种基因变体与选自以下的疾病相关联：21-羟化酶缺乏症、abcc8相关高胰岛素症、arsacs、软骨发育不全、全色盲、腺苷单磷酸脱胺酶1、胼胝体发育不全伴神经元病、黑尿症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、α-甘露糖储积症、α-肌聚糖病、α-地中海贫血；阿尔茨海默症，血管收缩素ii受体i型、脂蛋白e基因分型；精胺琥珀酸尿症、天门冬葡萄糖胺尿、运动失调伴维生素e缺乏、运动失调毛细管扩张症、自体免疫多内分泌病变综合征1型、brca1遗传性乳腺癌/卵巢癌、brca2遗传性乳腺癌/卵巢癌、bardet-biedl二氏综合征、best卵黄囊状黄斑失养症、β-肌聚糖病、β-地中海贫血、生物素酶缺乏症、blau综合征、bloom综合征、cftr相关病症、cln3相关神经性类蜡脂褐质病、cln5相关神经性类蜡脂褐质病、cln8相关神经性类蜡脂褐质病、canavan病、肉毒碱棕榈酰转移酶ia缺乏症、肉毒碱棕榈酰转移酶ii缺乏症、软骨-毛发发育不良、脑海绵状畸形、无脉络脉畸型、cohen氏综合征、先天性白内障、面部异形及神经病变、先天性糖基化障碍la、先天性糖基化障碍ib、先天性芬兰肾病、克隆氏病、胱氨酸病、dfna 9(coch)、糖尿病及听力损失、早发性原发性肌紧张不足(dyti)、herlitz-pearson型交界型水疱性表皮松解症、fancc相关fanconi贫血、fgfr1相关颅缝线封闭过早、fgfr2相关颅缝线封闭过早、fgfr3相关颅缝线封闭过早、第五因素leiden血栓好发症、第五因素r2突变血栓好发症、第十一因素缺乏症、第十三因素缺乏症、家族性腺瘤性息肉病、家族性自主神经障碍、家族性高胆固醇血症b型、家族性地中海热、游离唾液酸存储障碍、额颞叶痴呆伴帕金森氏症17、延胡索酸酶缺乏症、gjb2相关dfna 3型非综合征性听力损失及耳聋、gjb2相关dfnb 1非综合征性听力损失及耳聋、gne相关肌病、半乳糖血症、gaucher氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、戊二酸血症1型、糖原贮积病1a型、糖原贮积病ib型、糖原贮积病ii型、糖原贮积病iii型、糖原贮积病v型、gracile综合征、hfe相关联的遗传性血铁沉积症、halder aims、血红蛋白sβ-地中海贫血、遗传性果糖不耐受、遗传性胰腺炎、遗传性胸腺嘧啶-尿嘧啶尿症、己糖胺酶a缺乏症、有汗性外胚层发育异常2、胱硫醚β-合酶缺乏引起的高胱氨酸尿症、高钾血周期性麻痹1型、高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿综合征、原发性高草酸盐尿症1型、原发性高草酸盐尿症2型、软骨生成减退、低钾血周期性麻痹1型、低钾血周期性麻痹2型、低磷酸酶症、婴儿肌病及乳酸性酸中毒(致死型和非致死型)、异戊酸血症、krabbe病、lgmd2i、leber遗传性视神经病变、法国-加拿大型leigh综合征、长链3-羟酰基-辅酶a脱氢酶缺乏症、melas、merrf、mthfr缺乏症、mthfr不耐热变异、mtrnr1相关听力损失及耳聋、mtts1相关听力损失及耳聋、myh相关联的息肉病、枫糖浆尿病1a型、枫糖浆尿病1b型、马科恩-亚百特氏综合征、中链酰基辅酶a脱氢酶缺乏症、巨脑白质病伴皮质下囊肿、异染性白质失养症、线粒体心肌病、线粒体dna相关联的leigh综合征及narp、粘脂贮积病iv、黏多糖病i型、黏多糖病iiia型、黏多糖病vii型、多发性内分泌瘤2型、肌-眼-脑疾病、线样肌病、神经表型、由于神经磷脂酶缺乏引起的尼曼-匹克病、尼曼-匹克病c1型、奈梅亨染色体断裂综合征、ppt1相关神经性类蜡脂褐质病、prop1相关下垂体激素缺乏症、pallister-hall综合征、先天性肌刚痉病、pendred综合征、过氧化体双功能酶缺乏症、广泛性发展障碍、苯丙氨酸羟化酶缺乏症、血浆蛋白原活化因子抑制物i、常染色体隐性遗传多囊肾病、凝血酶原g20210a血栓好发症、假维生素d缺乏性佝偻病、致密成骨不全症、bothnia型常染色体隐性色素沉着性视网膜炎、雷特氏综合征、肢根性点状软骨发育异常1型、短链酰基辅酶a脱氢酶缺乏症、shwachman-diamond综合征、sjogren-larsson综合征、smith-lemli-opitz综合征、痉挛性截瘫13、硫酸盐转运蛋白相关骨软骨发育不良、tfr2相关遗传性血色病、tpp1相关神经性类蜡脂褐质病、致死性软骨发育不全、运甲状腺素蛋白淀粉样变性、三功能蛋白缺乏症、酪氨酸羟化酶缺乏性drd、酪氨酸血症i型、wilson氏病、x性联青年性视网膜劈裂症、囊肿纤维化、脊髓性肌肉萎缩症(sma)、血红素病、和zellweger综合征谱系。

48、在另一方面中，本公开提供了富集生物样本中的游离胎儿dna(cffdna)的方法，其包括从孕妇获得包括游离dna(cfdna)的生物样本，其中所述cfdna包括cffdna和游离母体dna(cfmdna)；从所述生物样本中萃取所述cfdna；及使所萃取的cfdna经受大小排除过程，其中所述大小排除过程具有约150个核苷酸长度、约155个核苷酸长度、约160个核苷酸长度、约165个核苷酸长度、约170个核苷酸长度、约175个核苷酸长度、或约180个核苷酸长度的截止大小，从而产生富集cffdna的样本。

49、在另一方面中，本公开提供了计算机模拟处理游离dna(cfdna)的方法，其包括对包括游离胎儿dna(cffdna)和游离母体dna(cfmdna)的cfdna样本进行测序以制备序列库；进行基于读段长度的分析，其中在所述序列库的至少两个窗口中建立感兴趣的核酸序列的等位基因平衡；以及基于所述至少两个窗口的所述等位基因平衡建立轨迹。

50、在另一方面中，本公开提供了在非侵入性产前筛查(nips)中减少来自多余遗传物质的背景噪声的方法，其包括

51、(i)从孕妇获得生物样本，其中所述生物样本包括游离dna(cfdna)；及

52、(ii)处理用于nips的cfdna，其中处理包括富集所述生物样本中的游离胎儿dna(cffdna)、对所述cfdna进行计算机模拟处理、或其组合。

53、在一些实施例中，处理包括富集所述生物样本中的游离胎儿dna(cffdna)富集和对所述cfdna进行计算机模拟处理两者。

54、在一些实施例中，富集所述生物样本中的游离胎儿dna(cffdna)包括本文所公开的富集生物样本中的游离胎儿dna(cffdna)的方法中的任一种。

55、在一些实施例中，对所述cfdna进行计算机模拟处理包括本文所公开的对游离dna(cfdna)进行计算机模拟处理的方法中的任一种。

56、在一些实施例中，所述方法可进一步包括正规化以控制gc偏差、样本背景、杂交探针捕获、或其组合。

57、以下实施方式是示范性及解释性的，但不旨在限制。