一种抗原组合及其应用的制作方法

本公开属于生物技术检测领域，具体涉及一种羊痘病毒属抗原组合及其应用。

背景技术：

1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)是一种由痘病毒科(poxiviridae)、脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxvirunae)、羊痘病毒属(capripoxvirus)的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，lsdv)引起的急性、亚急性传染病。临床上以发热、消瘦、淋巴结肿大、皮肤水肿、局部形成坚硬的结节或溃疡等为主要特征。

2、lsd首次在非洲的赞比亚地区被发现，此后逐渐向北扩散，主要在撒哈拉以南地区流行。之后传入部分亚欧国家，扩散至塞尔维亚、阿尔巴尼亚和俄罗斯等国家，逐步靠近我国。2019年左右，我国在新疆伊犁地区首次确诊该病，农业农村部暂时将其列为二类动物疫病。

3、lsdv可致原发性和继发性肺炎，导致母牛流产以及公牛暂时或永久不育，奶牛生产性能、泌乳性能显著下降，皮张利用价值大大降低等。lsdv可通过蚊、蝇和虱等吸血昆虫叮咬传播，发病率在5％～45％之间，病死率可达20％，严重影响养牛业的经济贸易，被世界动物卫生组织(woah)列为必须通报的动物疫病。

4、lsd主要通过临床和实验室诊断检测方法进行确诊，其中实验室诊断包括病毒的分离与鉴定、分子生物学和血清学诊断检测等。临床诊断方法主要适用于重症lsd病例的诊断，而对于感染初期、轻度或无症状的lsd病例，无法通过临床诊断方法进行区分，则需要采用实验室检测方法进行确诊。病毒中和试验(vn)是血清学检测中特异性最高的方法，而且是woah规定的检测lsdv抗体的金标方法，但是由于lsdv感染后产生的中和抗体水平较低，因此该方法的敏感性欠佳，并且vn要求操作者具有较高水平的病毒操作技术和丰富的经验，还需要在bsl-3实验室进行。

5、目前，还没有针对lsd的有效的治疗方法，疫苗接种和积极的血清监测仍然是控制病毒传播的最有效措施。目前只有商品化弱毒活疫苗(lav)用于预防lsd，包括同源弱毒活疫苗和异源羊痘弱毒活疫苗。无论是同源疫苗还是异源疫苗，大都具有良好的临床保护效果，但部分疫苗不能提供足够的免疫保护，并且大部分疫苗都具有不同程度的副作用。

技术实现思路

1、为了解决以上至少一个问题，本公开提供了一种牛结节性皮肤病抗原组合及其应用。本公开所提供的抗原组合，具有良好的免疫原性，与抗体结合的特异性高，能够大大提高免疫效果。

2、根据本公开的第一方面，提供了一种抗原组合，所述抗原组合包括：p32蛋白或其片段，和，l1r蛋白或其片段。

3、在一些实施方式中，所述p32蛋白具有如seq id no:1所示的氨基酸序列或与其具有85％以上同一性的氨基酸序列。

4、在一些实施方式中，所述p32蛋白的片段具有对应于如seq id no：1所示氨基酸序列的第26～195位的氨基酸片段、第18～257位的氨基酸片段和/或31～179位的氨基酸片段，或与其具有85％以上序列同一性的氨基酸序列。

5、在一些实施方式中，所述p32蛋白的片段具有如seq id no:4～6中任一项或多项所示的氨基酸序列，或与其具有85％以上同一性的氨基酸序列。

6、在一些实施方式中，所述l1r蛋白具有如seq id no:2所示的氨基酸序列，或与其具有85％以上序列同一性的氨基酸序列。

7、在一些实施方式中，所述抗原组合还包括增强免疫原性的外源蛋白。

8、在一些实施方式中，所述增强免疫原性的外源蛋白包括破伤风毒素t细胞表位p2、霍乱毒素b亚基、大肠杆菌不耐热毒素b亚基、布鲁氏杆菌二氧四氢喋啶合成酶、颗粒性蛋白鼠多瘤病毒vp1、诺如病毒衣壳蛋白或其片段。

9、在一些实施方式中，所述增强免疫原性的外源蛋白为破伤风毒素t细胞表位p2。

10、在一些实施方式中，所述增强免疫原性的外源蛋白具有如seq id no:8所示的氨基酸序列，或与其具有85％以上序列同一性的氨基酸序列。

11、在一些实施方式中，所述抗原组合包括所述p32蛋白或其片段与所述l1r蛋白或其片段的混合物；和/或

12、所述抗原组合包括所述增强免疫原性的外源蛋白、所述p32蛋白或其片段与所述l1r蛋白或其片段的混合物；和/或

13、所述抗原组合包括所述p32蛋白或其片段与所述l1r蛋白或其片段的融合蛋白；和/或

14、所述抗原组合包括所述增强免疫原性的外源蛋白、所述p32蛋白或其片段与所述l1r蛋白或其片段形成融合蛋白。

15、在一些实施方式中，所述混合物中所述p32蛋白或其片段与所述l1r蛋白或其片段的重量比例为(1～10)：(1～10)；和/或

16、所述混合物中所述增强免疫原性的外源蛋白、所述p32蛋白或其片段与所述l1r蛋白或其片段的重量比例为(1～10)：(1～10)：(1～10)。

17、在一些实施方式中，所述融合蛋白中，所述p32蛋白或其片段，所述l1r蛋白或其片段和所述强免疫原性的外源蛋白中任两者之间直接连接或间接连接。

18、在一些实施方式中，所述间接连接包括通过连接子连接。

19、在一些实施方式中，所述连接子包括柔性连接子。

20、在一些实施方式中，所述柔性连接子的氨基酸序列选自(gns)m、(g)n、(ea3k)n或(xp)n所示的氨基酸序列中的一种或多种，其中n和m各自独立地选自0～5的整数。

21、在一些实施方式中，所述融合蛋白从n端到c端顺序包括p32蛋白或其片段，l1r蛋白或其片段；或者，

22、所述融合蛋白从n端到c端顺序包括增强免疫原性的外源蛋白，p32蛋白或其片段，l1r蛋白或其片段。

23、在一些实施方式中，所述融合蛋白具有如seq id no:9或10所示的氨基酸序列，或与其具有85％以上序列同一性的氨基酸序列。

24、在一些实施方式中，所述抗原组合具有可溶性。

25、根据本公开的又一方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码所述抗原组合。

26、在一些实施方式中，所述表达载体包括穿梭质粒、杆状病毒等，例如pfastbac1。

27、根据本公开的又一方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括所述核酸分子。

28、根据本公开的又一方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述核酸分子。

29、在一些实施方式中，提供了所述宿主细胞选自原核细胞和/或真核细胞。

30、在一些实施方式中，所述原核细胞包括细菌细胞、大肠杆菌或链霉菌中的一种或多种。

31、在一些实施方式中，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞，例如dh5α、dh10bac、xl10-gold、tg1、stbl2、bj5183、hb101或turbo中的一种或多种。

32、在一些实施方式中，所述真核细胞包括酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞中的一种或多种。

33、在一些实施方式中，所述昆虫包括鳞翅目昆虫。

34、在一些实施方式中，所述昆虫包括但不限于家蚕(bombyx mori linnaeus)、甘蓝夜蛾(mamestra brassicae linnaeus)、草地贪夜蛾蛹(spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(trichoplusia ni)、赤眼蜂(trichogrammatid)中的一种或多种。

35、在一些实施方式中，所述昆虫细胞包括但不限于sf9昆虫细胞、sf21昆虫细胞、sf+细胞系或high five细胞中的一种或多种。

36、在一些实施方式中，所述哺乳动物包括小鼠、大鼠、鸡、兔、狗、猴、牛、羊或猪中的一种或多种。

37、在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞包括3t3细胞、10t1/2细胞、bhk细胞、mdck细胞、cos1细胞、cos7细胞、bsc1细胞、bsc40细胞、bmt10细胞、lt细胞或c2c12细胞中的一种或多种。

38、根据本公开的又一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括所述抗原组合。

39、在一些实施方式中，所述药物组合物包括药学上可用的辅料。

40、在一些实施方式中，所述药物组合物包括疫苗组合物。

41、根据本公开的又一方面，提供了一种检测试剂盒，其包括所述抗原组合。

42、在一些实施方式中，所述试剂盒用于检测羊痘病毒相关抗体。

43、在一些实施方式中，所述羊痘病毒包括牛结节性皮肤病病毒、山羊痘病毒和/或绵羊痘病毒。

44、根据本公开的又一方面，提供了一种检测方法，所述方法包括使用所述抗原组合检测羊痘病毒相关抗体。

45、在一些实施方式中，所述羊痘病毒包括牛结节性皮肤病病毒、山羊痘病毒和/或绵羊痘病毒。

46、根据本公开的又一方面，提供了所述抗原组合、所述核酸分子、所述表达载体或所述宿主细胞在诊断、预防或治疗羊痘病毒相关感染中的应用。

47、在一些实施方式中，所述羊痘病毒包括牛结节性皮肤病病毒、山羊痘病毒和/或绵羊痘病毒。

48、根据本公开的又一方面，提供了所述抗原组合、所述核酸分子、所述表达载体或所述宿主细胞在制备抗体中的应用。

49、在一些实施方式中，所述抗体为针对羊痘病毒的中和抗体。

50、在一些实施方式中，所述羊痘病毒包括牛结节性皮肤病病毒、山羊痘病毒和/或绵羊痘病毒。

51、本公开的有益效果：

52、(1)本公开首次提出将lsdv p32重组蛋白或其片段与l1r重组蛋白或其片段联用的方案，无论是用于免疫还是检测，均取得了良好效果，显著优于lsdv p32蛋白或其片段，以及l1r蛋白或其片段单独使用的效果。

53、(2)本公开进一步将p32重组蛋白或其片段和l1r蛋白或其片段的全长基因序列进行串联并在n端添加通用cd4+辅助t细胞表位序列(破伤风毒素p2基因)后构建重组质粒，进行串联蛋白的重组表达，尤其是采用真核表达系统进行表达，所获得的串联蛋白为可溶性的，能够正确的折叠为功能性构象，且表达量高、纯度高，适于大量生产。

54、(3)本公开利用p32重组蛋白或其片段和l1r蛋白或其片段串联融合蛋白或p32重组蛋白或其片段和l1r蛋白或其片段的混合物作为包被抗原，以间接elisa检测lsdv阴阳性血清，均取得了良好的检测结果，阴阳性血清较使用单一蛋白时区别更为明显。p32重组蛋白或其片段和l1r蛋白或其片段的抗原组合在lsdv及羊痘感染的检测方面有良好的应用前景。

55、(4)本公开利用高纯度的lsdv p32n+l1r串联蛋白，尤其是真核表达的串联蛋白，作为免疫原制备多抗，经中和试验确定所制备的多抗具有很好的中和效应，且中和效应远远高于未添加p2的p32n+l1r串联蛋白以及p32n蛋白和l1r蛋白单一抗原制备的多抗。本公开在串联蛋白n端添加通用cd4+辅助t细胞表位序列，促进了特异性的cd4+辅助t细胞识别抗原肽-mhc ii复合物的激活，增强了b细胞的活化和增殖，有助于产生持续的免疫应答，便于分泌高水平的中和抗体，大大提高了免疫效果和中和抗体的筛选成功率，为lsdv及羊痘相关中和抗体的研制与筛选提供了有力工具。