一种绵羊早期胚胎骨髓间充质干细胞体外培养方法

本发明属于生物工程，具体是一种绵羊早期胚胎骨髓间充干细胞的分离、体外培养及鉴定方法。

背景技术：

1、骨髓间充干细胞是从骨髓中分离出，它是一种组织特异性干细胞，在脊椎动物发育过程中，骨髓间充质干细胞能够转化为骨组织，在产生骨骼发育、维持和修复骨骼损伤发挥着至关重要的作用，同时它具有高度分化能力，可定向分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和神经细胞等。由于骨髓间充质干细胞具有来源方便、扩增迅速、可塑性强、离成熟细胞近和多向分化潜能，并且异体移植时不会出现免疫排斥反应，这些特点使其成为胚胎发育、细胞移植及组织工程重要细胞来源。

2、骨髓间充质干细胞在骨髓中含量较少，只占骨髓中有核细胞的0.001-0.01%。目前，分离骨髓间充质干细胞方法有密度梯度离心法、全骨髓贴壁筛选法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠法和细胞表面分子标记分选法等，这些方法根据细胞表面的特异性分子、细胞的沉降系数、细胞贴壁特性以及细胞体积大小的细胞特性对细胞进行分离和纯化，然而密度梯度离心法、细胞表面分子标记分选法操作流程较为繁琐，且在操作过程中易破坏骨髓间充质干细胞的生长微环境；而流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法虽可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞，但对细胞活性有较大损伤，且价格昂贵，难以普及，且存在一定的局限性。

3、而早期胚胎个体提供的骨髓间充质干细胞其细胞活性和分化能力明显强于成年个体，然而早期胚胎的骨组织多为软骨组织，依据传统的针孔注射器方法冲洗骨髓很难有效分离骨髓间混合物质，且获得的骨髓细胞数量较少，因此本研究采用破碎骨组织法和全骨髓贴壁筛选法相结合的方法，先获取大量骨髓间物质，再对其进行全骨髓贴壁筛选。该方法能有效利用原材料，节约实验成本，同时操作简单，可快速将细胞移置体外培养微环境，避免细胞出现大量死亡现象。在分离3-4d后大部分细胞已经开始增殖，在倒置显微镜下观察细胞呈梭形、三角形或多边形。该方法分离出的骨髓间充干细胞的成活率和纯度均较高，且可通过骨髓间充质干细胞表达的标志物即可快速进行细胞鉴定，其中cd44、cd29、cd106、cd90阳性表达，cd31和cd45为阴性表达。因此，现阶段需要开发一种操作步骤简单、快捷，且可获得一种快速可靠、简便稳定的骨髓间充质干细胞培养体系，以便科研工作进行更深入的研究和应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种绵羊早期胚胎骨髓间充干细胞的分离、体外培养与鉴定的方法，为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

2、本发明提供了一种绵羊早期胚胎骨髓间充干细胞的分离、原代培养及鉴定的方法，本发明所述方法适用于绵羊早期胚胎来源骨髓间充干细胞的培养，具有高效运用原材料、操作便捷、和获得高纯度、高活性、高分化潜能、细胞状态好的骨髓间充质干细胞以及成本低的优势。包括如下步骤：

3、用无菌pbs清洗胎羊四肢骨头，运用破碎骨组织法获大量骨髓细胞，再对其进行全骨髓贴壁筛选，待从胎羊骨髓中冲来的细胞在4-5d后进行观察，可明显观察到悬浮未贴壁细胞与贴壁细胞，此时可更换培养皿全部的培养液，去除悬浮未贴壁的血细胞，贴壁细胞为骨髓间充质干细胞。

4、所述绵羊胚胎为30-50日龄胚胎，胚胎体长约3-7cm。

5、所述破碎骨组织法为用含1%双抗的无菌pbs轻轻地清洗骨清洗3遍后，用灭菌剪刀将骨头沿纵向从中间剪开，用无菌镊子将剪开的骨头放入1.5ml离心管，用含15% fbs的完全培养基液冲洗反复冲洗骨头，洗至骨头中间颜色变白，吸出培养液至新的1.5ml离心管中，1000rpm离心5min后，弃除废液，用移液器加入1.5ml的15% fbs的完全培养基液使沉淀重悬，即为骨髓细胞悬液。

6、所述细胞培养液为以高糖dmem为基础培养基、15%胎牛血清、1%双抗。

7、所述培养环境为为37ºc、5%co2、100%相对湿度的细胞培养箱。

8、所述细胞培养皿为60mm大小的细胞培养皿，在培养过程中，3d后更换培养皿一半培养液，4-5d后更换全液，之后每隔1.5d换一次培养液，待原代培养的细胞汇合度达90%时进行传代培养。

9、所述双抗为青霉素和链霉素。

10、本发明公开了以下技术效果

11、本发明公开了一种绵羊早期胚胎骨髓间充干细胞的分离、体外培养与鉴定的方法，通过分离30-50日龄的绵羊胎羊四肢骨头，采用破碎骨组织法和全骨髓贴壁筛选法相结合的方法分离出胎羊骨髓间充干细胞，使用细胞培养液进行培养。

12、本发明对分离的胎羊骨髓间充干细胞进行传代、冻存、复苏，测定其生长曲线与复苏前后成活率，验证得到的细胞的活性强度，通过荧光定量、琼脂糖凝胶电泳、免疫荧光验证验证分离纯化得到的细胞是骨髓间充干细胞，并对其进行成脂、成骨诱导分化，验证其具备干细胞特性。

13、该方法具有高效运用原材料、节约成本、操作便捷的优势，且培养的骨髓间充干细胞数量多、纯度高、细胞活性强的特点，为后期研究绵羊胚胎发育奠定了基础，同时也为细胞移植及组织工程等研究提供实验材料。

技术特征：

1.一种绵羊早期胚胎骨髓间充干细胞的分离、体外培养和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于：用含15%胎牛血清的基础培养液基，不同于一般10%胎牛血清的培养液，只增加血清浓度促进细胞快速增长，勿需添加其它营养因子，即可满足细胞正常生长。

3.如权利要求1所述的胚胎期绵羊为30-50日龄胚胎，胚胎体长约为3-7cm，此时胎羊骨干多为软骨组织，骨腔空隙较少。

4.根据权利要求1所述的破碎骨组织法，其特征在于：用含1%双抗的无菌pbs轻轻地清洗四肢骨头清洗3遍后，用灭菌剪刀沿骨头纵向从中间剪开，用将灭菌镊子其放入1.5ml离心管，用含15% fbs的完全培养基液冲洗反复冲洗骨头，洗至骨头中间颜色变白，吸出培养液至新的1.5ml离心管中，1000rpm离心5min后，弃除废液后加入1.5ml的15% fbs的完全培养基液进行重悬，即为骨髓细胞悬液，该方法优化了传统的用针孔注射器冲洗骨髓法，可获得大量的骨髓间充干细胞。

5.根据权利要求1所述的全骨髓贴壁筛选法，其特征在于：细胞培养约3d后可明显观察到悬浮未贴壁细胞与贴壁细胞，贴壁细胞为骨髓间充质干细胞，悬浮未贴壁细胞为血细胞，此时可更换培养皿一半培养液，待4-5d后更换全液，主要基于骨髓间充质干细胞的贴壁生长特性，由于血细胞不贴壁，此时更换培养皿全部的培养液，去除悬浮的血细胞和骨髓间其他它物质，起到纯化细胞的的作用。

6.根据权利要求1所述的鉴定，其特征在于：通过检测骨髓间充干细胞标志物的表达鉴定细胞类型。

7.根据权利要求1所述的鉴定，其特征在于：通过成脂、成骨诱导分化鉴定骨髓间充干细胞的分化能力。

8.根据权利要求5所述的标志物，其特征在于：细胞标志物为cd31、cd34、cd44、cd29、cd106、cd90，其中cd44、cd29、cd106、cd90阳性表达，cd31和cd45为阴性表达。

9.根据权利要求6所述的成脂诱导分化，其特征在于：诱导分化试剂为高糖dmem、10%胎牛血清、1%双抗、牛胰岛素、地塞米松和ibmx。

10.根据权利要求6所述的成骨诱导分化，其特征在于：诱导分化试剂为高糖dmem、10%胎牛血清、1%双抗、地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。

技术总结本发明公开了一种绵羊早期胚胎骨髓间充质干细胞体外培养方法，涉及生物工程技术领域，具体为一种胎龄30‑50天的绵羊早期骨髓间充质干细胞分离、体外培养及鉴定的系统性方法，所述培养方法包括以下步骤：(1)骨髓间充质干细胞的分离与原代培养；(2)骨髓间充质干细胞的传代；(3)骨髓间充质干细胞的冻存；(4)骨髓间充质干细胞的复苏；(4)骨髓间充质干细胞的生长曲线和成活率检测；(5)骨髓间充质干细胞的鉴定；(6)骨髓间充质干细胞的诱导分化。本发明运用破碎骨组织法和全骨髓贴壁筛选法结合的创新性方法，该方法具有高效运用原材料、操作方法简单、和获得高纯度、高活性、高分化潜能、生长状态良好的骨髓间充质干细胞的特点，可在3‑4天内高效获取大量绵羊早期胚胎骨髓间充干细胞，且细胞活性稳定、细胞干性较成年动物骨髓间充质干细胞强，可进行连续传代。该发明为胚胎期动物骨髓间充质干细胞的进一步研究和应用提供了良好的基础，为后期研究胚胎发育、细胞移植及组织工程等研究提供实验材料。技术研发人员：韩吉龙,李甜甜,杨敏,荣旭冉,张洁,窦明强,王咸书,李莹莹,许赫,梁千千,董华娇,杨素荣,杨海琛受保护的技术使用者：石河子大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29