一种高纯度EuphebracteolatinA的提取工艺、EuphebracteolatinA及其应用的制作方法

本技术涉及医药技术的领域，更具体地说，涉及一种高纯度euphebracteolatin a的提取工艺、euphebracteolatin a及其应用。

背景技术：

1、中药狼毒为《中国药典》收载的大戟科植物狼毒大戟和月腺大戟的干燥根，具有散结、杀虫功效，可外用于淋巴结结核、皮癣和灭蛆。近年来对狼毒的生物活性研究表明狼毒具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒、抗结核等药理活性。对狼毒的化学成分研究表明狼毒具有丰富的二萜类、三萜类、苯乙酮类、黄酮类等化学成分，其中二萜类成分可能与狼毒的抗肿瘤、抗病毒活性相关。

2、euphebracteolatin a是狼毒中一个玫瑰烷型二萜化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性，其对人卵巢癌细胞(sk-ov-3)、人肺癌细胞(a549&h460)表现出细胞毒或增殖抑制活性。

3、目前euphebracteolatin a的制备研究存在以下几种：

4、1.通过对20kg月腺大戟根茎进行粉碎、提取、萃取、反复硅胶分离、反相c18分离和凝胶sephadex lh-20分离获得83mg的euphebracteolatin a，得率仅为0.000415％。

5、2.从18kg的月腺大戟根茎中通过提取、萃取、反复硅胶分离和凝胶sephadex lh-20分离纯化出11.7mg的euphebracteolatin a，得率仅为0.000065％。

6、3.通过粉碎、提取、萃取、反复硅胶分离、凝胶sephadex lh-20分离和高压制备从67.0kg月腺大戟根茎中获得4.0mg的euphebracteolatin a，得率远低于百万分之一。

7、4.以铁海棠地上部分为原料，经粉碎、提取、萃取、反复硅胶分离、凝胶sephadexlh-20分离和高压半制备从3kg原料中获得3mg的euphebracteolatin a，得率为0.00013％。

8、对目前euphebracteolatin a的制备工艺进行总结可以判断，现有的工艺制备得率极低，一方面与euphebracteolatin a在药材中的含量有关，另一方面也与工艺过程复杂，且对euphebracteolatin a的纯化过程无针对性所致。

技术实现思路

1、为了提高euphebracteolatin a的纯度和得率，本技术提供一种高纯度euphebracteolatin a的提取工艺，可以获得高纯度(>98.5％)的样品，得率达到0.0024％以上，远远高于目前制备的得率；同时本发明也首次报道了euphebracteolatin a的抗肿瘤作用，其对人乳腺癌细胞(mcf-7细胞、sum149pt细胞、zr-75-1细胞和sk-br-3细胞)具有较高的增殖抑制作用，提示euphebracteolatin a可以作为治疗乳腺癌药物的应用。

2、第一方面，本技术提供一种高纯度euphebracteolatin a的提取工艺，采用如下的技术方案：

3、一种高纯度euphebracteolatin a的提取工艺，包括以下步骤：

4、s1、原料提取：将干燥月腺大乾药材粉碎，加入到体积分数为80％的乙醇水中回流提取两次，合并提取液后减压回收乙醇，将所得月腺大乾提取液加入到乙酸乙酯中萃取，将乙酸乙酯相减压浓缩，得到浸膏；

5、s2、硅胶柱层析：将萃取液过柱层析，以石油醚、乙酸乙酯和甲酸为流动相体系进行梯度洗脱，进行tlc检测，收集目标流出液，减压浓缩，得到粗提取物；

6、s3、高压制备：将粗提取物加入甲醇溶解，将所得混合液上制备型液相进行分离制备，流动相a为乙腈、b为0.1％甲酸水，按目标峰收集流出液，减压浓缩、冷冻干燥，即得euphebracteolatin a。

7、通过采用上述技术方案：由于euphebracteolatin a作为二萜类成分，极性偏低，乙醇水体系中乙醇的含量过低会导致目标的溶解度差，提出率降低；乙醇的含量过高会提出更多小极性成分不利于后续的分离，因此提取工序中的控制乙醇浓度为80％，以在保证充分提取目标化合物同时减少杂质的提出量。

8、萃取工序中，有机相的选择为乙酸乙酯。采用石油醚、乙醚为有机相进行萃取时，目标的萃取得率低，需要增加萃取次数保证萃取过程中目标得率。以氯仿或二氯甲烷萃取时，萃取得率与乙酸乙酯萃取得率接近，因此优选更易得廉价的乙酸乙酯为萃取溶剂。

9、硅胶柱层析以及高压制备工序中的流动相体系加入甲酸相，可明显抑制euphebracteolatin a在硅胶柱上的拖尾现象，减少目标在硅胶柱上的损失，缩短出峰溶液的体积，其原因与抑制euphebracteolatin a结构中的两个酚羟基的电离相关。

10、通过控制上述分离和纯化步骤条件，将euphebracteolatin a的纯度提高至98.7％以上，得率提高至0.0024％以上。

11、可选的，所述步骤s1，将月腺大乾提取液加入到乙酸乙酯中萃取前，先将月腺大乾提取液与水按体积比1:(0.25-0.34)混合。

12、通过采用上述技术方案：在萃取工序中，将月腺大乾提取液与水混合稀释后进行萃取。需要控制加水量处于上述范围内，加水量过少会导致萃取过程中更多大极性杂质溶解或分散到乙酸乙酯相；加水量过多对目标的萃出无明显改善，且增加有机溶剂消耗。

13、可选的，所述步骤s2，按照石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:1:0.01、石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝20:1:0.01梯度洗脱，收集石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝20:1:0.01段中含euphebracteolatin a的流出液。

14、通过采用上述技术方案：硅胶柱分离的目的是将极性差别较大的杂质与目标区分开，通过控制石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝50:1:0.01、20:1:0.01的比例洗脱，能充分地除去过小极性类成分和大极性成分，将euphebracteolatin a与其他类成分完全分开。

15、可选的，所述步骤s2，硅胶柱的硅胶粒径为200-300目。

16、通过采用上述技术方案：本步骤中，所用的填料为硅胶(sio2，二氧化硅)200-300目，更粗粒径的硅胶会导致分离效果降低，更细粒径的硅胶会有更好的分离效果，但需要借助相应的压力泵进行流动相的洗脱。因此此步骤中优选200-300目的硅胶。

17、可选的，所述步骤s3，将所得混合液上制备型液相进行分离制备中，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径为5-10μm。

18、可选的，所述步骤s3，梯度洗脱的具体条件为：

19、0-15min，70-88％b；

20、15-20min，88-95％b；

21、20-25min，95％b。

22、可选的，所述制备型液相色谱条件：进样量0.2-0.5g，流速为60ml/min，检测波长280nm，柱温为20℃。

23、第二方面，本技术提供一种euphebracteolatin a，由上述所述的高纯度euphebracteolatin a的提取工艺制备得到。

24、通过采用上述技术方案：在本技术的工艺条件下，所得euphebracteolatin a的纯度高、得率高，有利于euphebracteolatin a的规模化制备。

25、第三方面，本技术提供一种上述所述euphebracteolatin a在抗肿瘤药品中的应用。

26、通过采用上述技术方案：本发明发现euphebracteolatin a的抗肿瘤作用，其对人乳腺癌细胞(mcf-7细胞、sum149pt细胞、zr-75-1细胞和sk-br-3细胞)具有较高的增殖抑制作用，表明euphebracteolatin a应用到治疗乳腺癌药物当中。

27、综上所述，本技术具有以下有益效果：

28、1、本技术的工艺进行提取、硅胶柱层析和高压制备，针对euphebracteolatin a的极性，在提供工艺中限定乙醇浓度以充分提取euphebracteolatin a并减少杂质提出量；在硅胶柱层析和高压制备的流动相体系中加入甲酸相，抑制化合物结构中两个酚羟基的电离，减少损失，将euphebracteolatin a的纯度提高至98.5％以上，得率提高至0.0054％以上，远高于目前提取工艺的纯度和得率；

29、2、本技术采用梯度洗脱，充分去除小极性类成分和大极性成分，将euphebracteolatin a与其他类成分完全分开，提高纯度和得率；

30、3、本技术发现euphebracteolatin a的抗肿瘤作用，其对人乳腺癌细胞(mcf-7细胞、sum149pt细胞、zr-75-1细胞和sk-br-3细胞)具有较高的增殖抑制作用，表明euphebracteolatin a应用到治疗乳腺癌药物当中。