一种杜鹃属植物的组织培养方法与流程

本发明属于植物组织培养，具体涉及一种杜鹃属植物的组织培养方法。

背景技术：

1、杜鹃属植物不仅是植被群落的重要组成部分，也是重要的观赏植物资源。在杜鹃属植物的繁育中，现有的繁殖技术有种子繁殖、嫁接繁殖和压条繁殖。但是杜鹃属植物现有的繁殖技术有往往受到环境、技术条件和生长周期的限制。

2、随着生物技术的发展，组织培养技术作为现代植物繁殖的重要手段，通过离体培养植物的细胞、组织或器官，可以在无菌条件下诱导形成愈伤组织、丛生芽和根苗，从而实现植物的快速繁殖；组织培养技术已被广泛应用于植物的快速繁育、遗传改良和种质保存等方面。

3、杜鹃属植物对组织培养条件有较高的要求，包括营养成分、植物生长调节剂浓度、光照、温度和湿度等环境因素。第一营养成分和植物提取物不足将会导致组织培养的增殖速度慢；第二生长素和细胞分裂素以及其他可添加的生长调节剂的浓度和比例控制不精确将导致组织培养的成活率和组织培养的生根率低；第三营养成分、生长调节剂和环境因素的不适宜往往导致组织培养成功率低。

技术实现思路

1、针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种杜鹃属植物的组织培养方法，该方法增殖速度比传统增殖速度提高25%~30%，组织培养成功率可以达到95%以上。

2、为了实现上述目的，该杜鹃属植物的组织培养方法，包括如下步骤：

3、（1）制备培养基，所述培养基包括ms培养基、营养成分、植物提取物浓度20~200ml/l和植物生长调节剂浓度0.70~2.1mg/l；

4、（2）设置环境条件、执行无菌操作、灭菌以及培养过程的监控与调整所述的ms培养基还包括大量元素、微量元素、有机物、其他添加物和水，所述ms培养基ph值为5.7~5.8。

5、ms培养基的配方和各组分的占比：

6、硝酸钾（kno3）浓度为1850~1950mg/l、硝酸铵（nh4no3）浓度为1600~1700mg/l、磷酸二氢钾（kh2po4）浓度为165~175mg/l、硫酸镁（mgso4•7h2o）浓度为370~375mg/l、钙硫酸盐（caso4•2h2o）浓度为226~234mg/l；

7、乙二胺四乙酸铁钠（nafeedta•4h2o）浓度为27.5~28.0mg/l、硫酸锰（mnso4•h2o）浓度为22.0~22.5mg/l、硫酸硼（h3bo3）浓度为6.0~6.5mg/l、硫酸锌（znso4•7h2o）浓度为8.0~9.0mg/l、钼酸钠（na2moo4•2h2o）浓度为0.2~0.3mg/l、硫酸铜（cuso4•5h2o）浓度为0.02~0.03mg/l；

8、甘氨酸（glycine）浓度为1.5~2.5mg/l、维生素b1（thiamine•hcl）浓度为0.35~0.45mg/l、维生素b6（pyridoxine•hcl）浓度为0.45~0.55mg/l、烟酸（nicotinic acid）浓度为0.45~0.55mg/l、肌醇（inositol）浓度为95~105mg/l；

9、琼脂用于固化培养基，通常添加量为6~8g/l；水：所有成分都溶解在去离子水或蒸馏水。

10、硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和钙硫酸盐为大量元素，大量元素为培养基的提供基本营养，参与细胞的结构组成、能量代谢，调节生理过程。

11、乙二胺四乙酸铁钠、硫酸锰、硫酸硼、硫酸锌、钼酸钠和硫酸铜为微量元素；微量元素在含量虽少，但它对植物的生长发育起着至关重要的作用。

12、甘氨酸、维生素b1、维生素b6、烟酸和肌醇为有机物；有机物可以满足离体植物细胞的营养需求，促进植物的生长和发育，在植物组织培养中具有重要的作用。

13、利用上述ms培养基的制备方法可以实现本发明最佳效果，市售的ms培养基也可以用于本发明。

14、步骤（1）所述的营养成分为蔗糖和酵母提取物；蔗糖为组织培养提供能量和碳源，支持其生长发育，还可以促进植物的生长和再生，提高细胞分化和成熟；酵母提取物不仅为组织培养提供了必要的营养成分，‌还优化了培养条件，‌促进了植物组织的生长和发展。

15、所述蔗糖为质量百分比浓度2~5%，酵母提取物为体积百分比浓度0.15~0.3%；所述浓度范围的蔗糖和酵母提取物，能够为杜鹃属植物组织培养提供的充足能量和营养物质。

16、步骤（1）所述的植物提取物为椰水提取物、迷迭香提取物、绿茶提取物或者薰衣草提取物中的一种或几种组合。上述4种植物提取物富含天然激素和营养物质，能有效促进植物细胞的增殖和分化，并且为植物提供必需的额外营养，从而显著提高培养效率。

17、所述椰水提取物为规格10：1的水提椰子提取物，即椰子水提物；所述迷迭香提取物为含量10：1的迷迭香水提物；所述绿茶提取物为规格10：1的绿茶水提物；所述薰衣草提取物由唇形科植物真薰衣草的花序经水蒸气蒸馏而得薰衣草精油，得率约0.78%~1.1%。

18、所述的椰子提取物、绿茶水提物和薰衣草精油的体积比为0.9~2：1.0~2.6：0.5~1.4。上述三种提取物在体积比为0.9~2：1.0~2.6：0.5~1.4的范围内相互配合，协同增效，在促进植物细胞的增殖和分化方面具有意料不到的协同增效的作用。

19、步骤（1）所述的植物生长调节剂包括生长素和细胞分裂素。

20、步骤（1）所述的植物生长调节剂包括生长素浓度0.2~0.6mg/l和细胞分裂素浓度0.5~1.2mg/l。所述生长素简称iaa，细胞分裂素简称ba，通过改变植物生长调节剂的浓度，能够实现对细胞分裂和伸长的精细调控，以优化植物生长。

21、细胞分裂素浓度大于生长素浓度有利于芽的分化，抑制根的分化；细胞分裂素浓度等于生产素浓度仅有利于促进细胞的生长，不利于根和芽的分化；细胞分裂素浓度小于生长素有利于根的分化，不利于芽的分化；只有当细胞分裂素和生长素比例合适才能有利于植物组织的生长。

22、步骤（1）所述的植物生长调节剂还包括赤霉素，赤霉素浓度0.1~0.30mg/l。赤霉素为ga3，ga3可以促进生根、发芽和生生长的过程，精确控制植物生长调节剂的浓度避免传统方法中常见的生长抑制或过度生长的情况，为植物组织提供最佳的生长条件，从而提高了生长质量。

23、步骤（2）所述的环境条件包括光照、温度和相对湿度，光照强度2000~3000lux；温度为20~25℃，相对湿度为70~80%。所述光照由led灯提供，光照条件模拟自然日照周期，促进植物的光合作用。光照强度和光周期根据植物的具体需求和生长阶段进行灵活调整，以适应不同杜鹃属植物的光合作用特性。利用智能环境控制系统，自动维持培养环境的温度在20~25℃，相对湿度在70~80%，为杜鹃属植物创造最适宜的生长环境。

24、步骤（2）所述的环境条件还包括co2浓度，co2浓度维持在400~600ppm。利用自动co2补充系统，将co2浓度维持在400~600ppm，优化植物的气体交换环境。

25、植物组织的无菌操作：在无菌工作台中进行所有操作，穿戴无菌操作服和手套，使用经过高压蒸汽灭菌的无菌工具。

26、培养基的灭菌：在121°c的高压蒸汽下对培养基进行15~20分钟的灭菌处理，为植物组织提供安全的生长环境。

27、培养过程的持续监控与及时调整：定期观察和记录植物组织的生长状况，包括生长速度、形态变化和组织颜色等指标。根据生长数据和观察结果，及时调整培养条件，包括培养基成分、光照、温度、湿度和co2浓度，为植物组织的健康生长和提高培养效率提供有利条件。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

29、（1）本发明通过改良ms培养基和植物生长调节剂的精确配比，以及植物提取物的添加，实现了杜鹃属植物组织培养增殖速度比传统增殖速度提高25%~30%，组织培养成功率可以达到95%以上。

30、（2）本发明通过精确控制生长素和细胞分裂素的浓度，以及其精确控制他可能添加的生长调节剂的浓度，提高了杜鹃属植物组织培的养生根率和成活率。

31、（3）利用组织培养的增殖方式有利于提高杜鹃属植物亲本和后代之间的遗传稳定性。

32、（4）本发明运用智能环境控制系统为植物组织培养提供了适宜的温度、湿度和co2浓度，模拟了最适宜杜鹃属植物生长的自然环境，提高了培养效率。

33、（5）本发明通过无菌操作和高压蒸汽灭菌，确保了培养基和整个培养环境的无菌性，有效预防了微生物污染。