通过操纵赤霉素代谢以增加可收获产量的用于矮小植物的方法和组合物与流程

领域本公开涉及用于改善单子叶植物或谷类植物(包括玉米)的性状(诸如抗倒伏性和增加的产量)的组合物和方法。相关领域赤霉素(gibberellin)(赤霉酸(gibberellic acid)或ga)是调节许多主要植物生长和发育过程的植物激素。在20世纪，半矮化小麦、水稻和高粱植物品种中ga水平的控制导致这些谷类作物产量的增加和倒伏的减少，这主要是造成绿色革命的原因。然而，在其他谷类作物诸如玉米中，还没有通过ga途径的操纵实现成功的产量增加。事实上，ga途径基因中的一些突变与玉米中与产量不相容的各种异型相关联，这使得研究人员不再通过操纵ga途径来寻找半矮化高产玉米品种。本领域需要开发具有增加的产量和/或抗倒伏性的单子叶或谷类作物植物，诸如玉米。

背景技术：

技术实现思路

技术特征：

1.一种重组dna构建体，其包含编码非编码rna分子的可转录dna序列，其中所述非编码rna分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源ga氧化酶蛋白的mrna分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源ga氧化酶蛋白与seq id no:30、33或173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一，并且其中所述可转录dna序列可操作地连接到植物可表达启动子。

2.如权利要求1所述的重组dna构建体，其中所述非编码rna分子包含与seq id no:28、29、31、32、171或172的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。

3.如权利要求1所述的重组dna构建体，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。

4.如权利要求3所述的重组dna构建体，其中所述维管启动子包括以下各项中的一项：蔗糖合酶启动子、蔗糖转运蛋白启动子、sh1启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(coymv)启动子、小麦矮化双生病毒(wdv)大基因间区域(lir)启动子、玉蜀黍条斑双生病毒(msv)外壳蛋白(cp)启动子、水稻类黄色条纹1(ys1)启动子、或水稻黄色条纹2(osysl2)启动子。

5.如权利要求3所述的重组dna构建体，其中所述维管启动子包含与seq id no:67、seqid no:68、seq id no:69、seq id no:70或seq id no:71中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的dna序列。

6.如权利要求1所述的重组dna构建体，其中所述植物可表达启动子是rtbv启动子。

7.如权利要求6所述的重组dna构建体，其中所述植物可表达启动子包含与seq id no:65或seq id no:66中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的dna序列。

8.如权利要求1所述的重组dna构建体，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。

9.如权利要求8所述的重组dna构建体，其中所述叶启动子包括以下各项中的一项：rubisco启动子、ppdk启动子、fda启动子、nadh-gogat启动子、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepc)启动子、或myb基因启动子。

10.如权利要求8所述的重组dna构建体，其中所述叶启动子包含与seq id no:72、seqid no:73或seq id no:74中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的dna序列。

11.如权利要求1所述的重组dna构建体，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。

12.如权利要求11所述的重组dna构建体，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：肌动蛋白启动子、camv 35s或19s启动子、植物泛素启动子、植物gos2启动子、fmv启动子、cmv启动子、mmv启动子、pclsv启动子、emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子、或玉蜀黍醇脱氢酶，或其功能部分。

13.如权利要求11所述的重组dna构建体，其中所述组成型启动子包含与seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq idno:81、seq id no:82或seq id no:83中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的dna序列。

14.如权利要求1所述的重组dna构建体，其中由所述可转录dna序列编码的所述非编码rna分子是在植物细胞中被加工或切割以形成成熟mirna或sirna的前体mirna或sirna。

15.如权利要求1所述的重组dna构建体，其中所述非编码rna分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源ga3氧化酶蛋白的mrna分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源ga3氧化酶蛋白与seq id no:30至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

16.如权利要求15所述的重组dna构建体，其中所述非编码rna分子包含与seq id no:28或29的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。

17.如权利要求1所述的重组dna构建体，其中所述非编码rna分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源ga3氧化酶蛋白的mrna分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源ga3氧化酶蛋白与seq id no:33至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

18.如权利要求17所述的重组dna构建体，其中所述非编码rna分子包含与seq id no:31或32的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。

19.如权利要求1所述的重组dna构建体，其中所述非编码rna分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源ga3氧化酶蛋白的mrna分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源ga3氧化酶蛋白与seq id no:173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

20.如权利要求19所述的重组dna构建体，其中所述非编码rna分子包含与seq id no:171或172的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。

21.一种转化载体，其包含如权利要求1所述的重组dna构建体。

22.一种转基因谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求1所述的重组dna构建体。

23.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物相对于对照植物具有以下性状中的一者或多者：较矮的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和/或增加的多产性。

24.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。

25.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的高度比野生型对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

26.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在一个或多个茎节间处的秆或茎直径比野生型对照植物在相同的一个或多个节间处的秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

27.如权利要求22中的任一项所述的转基因谷类植物，其中所述转基因谷类植物是玉米植物，并且其中所述转基因玉米植物在穗下方第一节间、第二节间、第三节间和/或第四节间中的一者或多者处的秆或茎直径比野生型对照植物的相同节间大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

28.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性ga的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。

29.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性ga的水平比野生型对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

30.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。

31.一种转基因玉米植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求1所述的重组dna构建体。

32.一种用于产生转基因谷类植物的方法，其包括：(a)用如权利要求1所述的重组dna构建体转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因谷类植物。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述谷类植物通过土壤杆菌介导的转化或粒子轰击进行转化。

34.一种重组dna构建体，其包含编码非编码rna分子的可转录dna序列，其中所述非编码rna分子包含第一靶向序列和第二靶向序列，其中所述第一靶向序列和所述第二靶向序列各自与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源ga氧化酶蛋白的mrna分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源ga氧化酶蛋白与seq id no:30、33和173中的一者或多者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

35.如权利要求34所述的重组dna构建体，其中所述非编码rna分子的所述第一靶向序列和所述第二靶向序列各自与seq id no:28、29、31、32、171和172中的一者或多者的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。

36.一种玉米或谷类植物，其包含通过诱变技术引入的在内源ga3氧化酶基因处或附近的突变，其中所述内源ga3氧化酶基因的表达水平在所述玉米或谷类植物中降低或消除，并且其中所述玉米或谷类植物相对于野生型对照植物具有较矮的植株高度。

37.如权利要求36所述的玉米或谷类植物，其中包含所述突变的所述玉米或谷类植物相对于所述对照植物具有以下附加性状中的一者或多者：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和增加的多产性。

38.如权利要求36所述的玉米或谷类植物，其中所述玉米或谷类植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

39.如权利要求36所述的玉米或谷类植物，其中所述玉米或谷类植物在一个或多个茎节间处的秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

40.如权利要求36所述的玉米或谷类植物，其中所述玉米或谷类植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性ga的水平低于所述对照植物的相同节间组织。

41.一种玉米或谷类植物，其包含经由靶向基因组编辑技术在内源ga3氧化酶基因的基因座处或附近引入的基因组编辑，其中所述内源ga3氧化酶基因的表达水平在所述玉米或谷类植物中相对于对照植物降低或消除，并且其中所述经编辑的玉米或谷类植物相对于所述对照植物具有较矮的植株高度。

42.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物相对于所述对照植物具有以下附加性状中的一者或多者：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和增加的多产性。

43.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

44.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

45.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性ga的水平低于所述对照植物的相同节间组织。

46.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性ga的水平比所述对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

47.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。

48.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述基因组编辑是使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、rna引导的核酸内切酶、tale核酸内切酶(talen)、重组酶或转座酶引入的。

49.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述基因组编辑包括相对于所述对照植物中的所述内源ga3氧化酶基因的序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入或倒位。

50.一种组合物，其包含引导rna，其中所述引导rna包含与玉米或谷类植物的内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶dna序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补的引导序列。

51.如权利要求50所述的组合物，其中所述引导rna分子包含与seq id no:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。

52.如权利要求50所述的组合物，其中所述引导rna分子包含与seq id no:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。

53.如权利要求50所述的组合物，还包含rna引导的核酸内切酶。

54.如权利要求53所述的组合物，其中所述rna引导的核酸内切酶在所述引导rna分子的存在下在所述玉米或谷类植物的基因组中的所述靶dna序列处或附近导致双链断裂或切口。

55.如权利要求50所述的组合物，还包含重组dna供体模板，所述重组dna供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶dna序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶dna序列是所述玉米或谷类植物的所述内源ga3氧化酶基因的所述基因组基因座处或附近的基因组序列。

56.一种重组dna构建体，其包含编码非编码引导rna分子的可转录dna序列，其中所述引导rna分子包含与玉米或谷类植物的内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶dna序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。

57.如权利要求56所述的重组dna构建体，其中所述引导rna包含与seq id no:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。

58.如权利要求56所述的重组dna构建体，其中所述引导rna分子包含与seq id no:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。

59.如权利要求56所述的重组dna构建体，其中所述可转录dna序列可操作地连接到植物可表达启动子。

60.如权利要求56所述的重组dna构建体，其中所述引导rna分子是crispr rna(crrna)或单链引导rna(sgrna)。

61.如权利要求56所述的重组dna构建体，其中所述引导rna包含与所述谷类植物的基因组中存在的紧邻所述内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的所述靶dna序列的原间隔序列邻近基序(pam)序列互补的序列。

62.如权利要求56所述的重组dna构建体，其中所述内源ga3氧化酶基因编码与seq idno:30、33或173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的蛋白质。

63.一种dna分子或载体，其包含如权利要求56所述的重组dna构建体。

64.一种细菌或宿主细胞，其包含如权利要求56所述的重组dna构建体。

65.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求56所述的重组dna构建体。

66.一种组合物，其包含如权利要求56所述的重组dna构建体，其中所述组合物还包含rna引导的核酸内切酶。

67.一种组合物，其包含如权利要求56所述的重组dna构建体，其中所述组合物还包含第二重组dna构建体，所述第二重组dna构建体包含编码rna引导的核酸内切酶的第二可转录dna序列。

68.如权利要求67所述的组合物，包含含有所述重组dna构建体和所述第二重组dna构建体的dna分子或载体。

69.一种组合物，其包含第一dna分子或载体和第二dna分子或载体，其中所述第一dna分子或载体包含编码靶向玉米或谷类植物的内源ga3氧化酶基因的引导rna分子的重组dna构建体，并且所述第二dna分子或载体包含编码rna引导的核酸内切酶的第二重组dna构建体。

70.如权利要求50、66或69所述的组合物，还包含重组dna供体模板，所述重组dna供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶dna序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶dna序列是玉米或谷类植物的内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。

71.一种重组dna供体模板，其包含至少一个同源序列，其中所述至少一个同源序列与靶dna序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶dna序列是玉米或谷类植物的内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。

72.如权利要求71所述的重组dna供体模板，其中所述至少一个同源序列相对于所述内源ga3氧化酶基因的所述基因组基因座处或附近的所述靶dna序列的互补链包含至少一个突变。

73.如权利要求71所述的重组dna供体模板，其中所述至少一个同源序列与seq id no:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。

74.如权利要求71所述的重组dna供体模板，其中所述至少一个同源序列与seq id no:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。

75.一种重组dna供体模板，其包含两个同源臂，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂包含与第一侧接dna序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，其中所述第二同源臂包含与第二侧接dna序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，并且其中所述第一侧接dna序列和所述第二侧接dna序列是玉米或谷类植物的内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。

76.如权利要求75所述的重组dna供体模板，还包含位于所述第一同源臂与所述第二同源臂之间的插入序列。

77.如权利要求75所述的重组dna供体模板，其中每个同源臂与seq id no:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。

78.如权利要求75所述的重组dna供体模板，其中每个同源臂与seq id no:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。

79.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求75所述的重组dna供体模板。

80.一种经工程改造的位点特异性核酸酶，其与玉米或谷类植物的内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶标位点结合并在所述靶标位点处导致双链断裂或切口。

81.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶或归巢核酸内切酶。

82.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含dna结合结构域和切割结构域的锌指核酸酶(zfn)。

83.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含dna结合结构域和切割结构域的转录激活因子样效应物核酸酶(talen)。

84.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中由所述位点特异性核酸酶结合的所述靶标位点与seq id no:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。

85.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中由所述位点特异性核酸酶结合的所述靶标位点与seq id no:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。

86.一种重组dna构建体，其包含编码位点特异性核酸酶的转基因，其中所述位点特异性核酸酶与单子叶植物或谷类植物的内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶标位点结合并在所述靶标位点处导致双链断裂或切口。

87.如权利要求86所述的重组dna构建体，其中所述转基因可操作地连接到植物可表达启动子。

88.如权利要求86所述的重组dna构建体，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶或归巢核酸内切酶、锌指核酸酶、或转录激活因子样效应物核酸酶(talen)。

89.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求86所述的重组dna构建体。

90.一种重组dna供体模板，其包含至少一个同源臂和插入序列，其中所述至少一个同源臂与玉米或谷类植物的基因组dna序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，并且其中所述插入序列包含含有编码非编码rna分子的可转录dna序列的重组dna构建体，其中所述非编码rna分子靶向单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的一种或多种内源ga3氧化酶基因进行遏制，并且其中所述可转录dna序列可操作地连接到植物可表达启动子。

91.如权利要求90所述的重组dna供体模板，其中所述至少一个同源臂包含两个同源臂，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，

92.如权利要求90所述的重组dna供体模板，其中所述可转录dna序列可操作地连接到植物可表达启动子。

93.如权利要求90所述的重组dna供体模板，其中所述非编码rna分子包含与编码ga氧化酶蛋白的mrna分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述ga氧化酶蛋白与seq id no:30、33或173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

94.一种转基因玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求90所述的重组dna供体模板的插入序列。

95.一种用于产生转基因玉米或谷类植物的方法，其包括：(a)用如权利要求94所述的重组dna供体模板转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因玉米或谷类植物包含所述重组dna供体模板的插入序列。

96.一种用于产生在内源ga3氧化酶基因处或附近具有基因组编辑的玉米或谷类植物的方法，其包括：

97.如权利要求96所述的方法，其中所述引入步骤(a)还包括引入非编码引导rna分子或包含编码非编码引导rna分子的可转录dna序列的第二重组dna构建体，其中所述引导rna分子包含与玉米或谷类植物的内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶dna序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。

98.如权利要求96所述的方法，其中所述引入步骤(a)还包括引入包含至少一个同源序列或同源臂的dna供体模板，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶dna序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶dna序列是所述玉米或谷类植物的所述内源ga3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。

99.如权利要求96所述的方法，还包括：

100.如权利要求99所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括使用分子测定来确定所述内源ga3氧化酶基因基因座是否被编辑。

101.如权利要求99所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括通过观察植物表型来确定所述内源ga3氧化酶基因是否被编辑。

102.一种经修饰的玉米植物，其具有小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，以及(i)大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。

103.如权利要求102所述的经修饰的玉米植物，其中所述玉米植物相对于野生型对照植物具有以下性状中的一者或多者：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和/或增加的多产性。

104.如权利要求102所述的经修饰的玉米植物，其中所述玉米植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性ga的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。

105.一种经修饰的谷类植物，其具有相对于野生型对照植物降低的植株高度，以及(i)相对于野生型对照植物增加的茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。

106.如权利要求105所述的经修饰的谷类植物，其中所述谷类植物的茎或秆中的一种或多种活性ga的水平低于野生型对照植物。

107.一种经修饰的玉米或谷类植物，其包含内源ga3氧化酶基因的突变等位基因，其中所述经修饰的玉米或谷类植物相对于对照植物具有较矮的植株高度。

108.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物对于所述内源ga3氧化酶基因的所述突变等位基因是纯合的。

109.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物包含所述内源ga3氧化酶基因的两个不相同的突变等位基因。

110.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物对于所述内源ga3氧化酶基因的所述突变等位基因是杂合的。

111.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述内源ga3氧化酶基因的所述突变等位基因包含通过诱变技术引入的所述内源ga3氧化酶基因中的一个或多个突变。

112.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述内源ga3氧化酶基因的所述突变等位基因包含通过靶向基因组编辑技术引入的所述内源ga3氧化酶基因中的一个或多个编辑或突变。

113.如权利要求112所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述一个或多个编辑或突变是使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、rna引导的核酸内切酶、tale核酸内切酶(talen)、重组酶或转座酶引入的。

114.如权利要求107所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述突变等位基因包括相对于所述对照植物中的所述内源ga3氧化酶基因的序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入或倒位。

115.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中相对于对照植物，所述玉米或谷类植物中所述内源ga3氧化酶基因的所述突变等位基因的活性和/或表达水平被降低或消除。

116.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物相对于所述对照植物具有以下附加性状中的一者或多者：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和增加的多产性。

117.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

118.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物在一个或多个茎节间处的秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

119.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性ga的水平低于所述对照植物的相同节间组织。

120.如权利要求107所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的所述植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性ga的水平比所述对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

121.如权利要求107所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。

技术总结本公开提供了用于改变玉米或其他谷类植物中的赤霉素(GA)含量的组合物和方法。还提供了用于通过遏制、诱变和/或编辑GA20或GA3氧化酶基因的特定亚型来改变与赤霉素生物合成相关的基因的表达的方法和组合物。还提供了具有降低GA氧化酶基因的表达或活性的遏制元件或突变的经修饰的植物细胞和植物，其包含降低的赤霉素水平和改善的特性，诸如降低的植株高度和增加的抗倒伏性，但没有异型。技术研发人员：T·帕西奥雷克,T·斯勒维斯基受保护的技术使用者：孟山都技术公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10