一种通过贻贝粘蛋白改性的无机骨粘合剂及其制备方法与流程

本发明属于医用粘合材料，具体涉及一种通过贻贝粘蛋白改性的无机骨粘合剂及其制备方法。

背景技术：

1、传统治疗粉碎性骨折的方法，主要是使用螺钉、钢板和钢针等内固定物来固定骨骼碎块，使其自行愈合恢复。但是传统治疗存在的弊端很多，最为明显的就是这些内固定物需要在骨骼碎块恢复愈合后，通过手术取出，容易对患者造成二次伤害且存在感染风险。基于此种问题，一种新型医用粘结材料“骨粘合剂”进入了研究人员的视野。目前商用的骨粘合剂主要有丙烯酸酯和氰基丙烯酸酯等类型的骨粘合剂，具有粘合强度高、力学性能好和易塑性等优点。但是医用骨粘合剂需要满足生物相容性高和生物安全性好，而丙烯酸酯和氰基丙烯酸酯等类型的骨粘合剂的较差生物相容性，可能会导致骨折处出现炎症反应，进而引发细菌感染。因此设计一种生物相容性良好的骨粘合剂具有重要意义。

2、生物相容性良好的骨粘合剂包括生物基水凝胶骨粘合剂、磷酸钙或磷酸镁等无机磷酸基骨粘合剂。无机磷酸基骨粘合剂由于与生物体具有优异的生物相容性且对细胞无毒，因此是一款非常安全的骨粘合剂。但是无机磷酸基系列的骨粘合剂存在粘结强度差和抗水性能不足等缺陷，因此研究提高无机磷酸基骨粘合剂的粘结强度和抗水性能，具有重要意义。

3、专利cn114917397b公开了一种骨粘合剂的固相组合物及骨粘合剂，该发明通过引入羧甲基化改性的多糖，使得羧甲基化改性的多糖羧酸结构上的氧原子，通过孤电子对于磷酸四钙中的二甲钙离子通过金属配位作用结合，形成网络结构，进而提高骨粘合剂的粘结强度。专利cn105731846b公开了一种磷酸镁骨水泥，该发明通过加入蜂蜡和透明质酸等促粘接材料，提高骨粘合剂的粘结强度。

4、贻贝粘蛋白是由贻贝腺体分泌的一种具有耐水性、高粘结强度的蛋白质，具有良好的生物相容性，不会引起人体免疫反应，等电点为9.5。贻贝粘蛋白具有优异的防水粘附性能，主要是由于蛋白中的多巴，多巴是酪氨酸在酪氨酸羟化酶的催化作用下产生的一种转录翻译后修饰的氨基酸，多巴经氧化又可以形成多巴醌，无论是多巴还是多巴醌，均可以在有机、无机和金属表面形成键交联或非键交联。

5、因此利用贻贝粘蛋白的高粘结性和耐水性，对磷酸基骨粘合剂进行改性，进而提高磷酸基骨粘合剂的粘结强度和抗水性能，具有重要意义。

技术实现思路

1、根据现有技术的不足，本发明通过将改性贻贝粘蛋白mfp3-5与改性壳聚糖混合制备得到复合固化液，改性贻贝粘蛋白mfp3-5表面带有大量正电荷，一方面通过静电吸附作用与改性壳聚糖表面的负电荷交联形成网状结构，另一方面改性壳聚糖上的醛基与改性贻贝粘蛋白mfp3-5上的亚氨基(-nh-)能够共价交联形成-c＝n-的网状结构，使得复合固化液粘接强度进一步的提升，复合固化液再与无机磷酸基骨粘合剂材料(如磷酸钙、磷酸镁)混合，通过改性壳聚糖上的羧酸基团结构，与无机磷酸基化合物的金属离子钙或金属离子镁通过阴阳离子键交联形成网状结构，通过多重交联的网状结构，协同提高了无机磷酸基骨粘合剂的粘接强度和抗水性能，用以解决背景技术中提出的问题。具体地，本发明的技术方案包括以下内容：

2、一种通过贻贝粘蛋白改性的无机骨粘合剂，所述无机骨粘合剂包括以下重量份的原料：

3、20～40重量份的无机磷酸基化合物、30～60重量份复合固化液和20～40重量份缓冲液；

4、所述无机磷酸基化合物包括磷酸钙、羟基磷灰石或磷酸镁；

5、所述复合固化液由改性贻贝粘蛋白mfp3-5和改性多糖按照质量比1～1混合后，加入乙醇进行研磨得到。

6、所述缓冲液由柠檬酸和柠檬酸钠按照质量比1:1复配得到。

7、进一步地，所述改性贻贝粘蛋白mfp3-5的制备方法包括以下步骤：

8、贻贝粘蛋白mfp3-5的cdna基因经pcr扩增后导入载体pet-28a中，然后转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞进行诱导培养得到含有重组贻贝粘蛋白mfp3-5的菌液；

9、对所述菌液进行裂解并离心收集沉淀，所述沉淀经缓冲液a溶解后离心收集上清液，所述上清液经缓冲液b和缓冲液c洗脱后，用5％醋酸透析收集得到重组贻贝粘蛋白mfp3-5；

10、所述重组贻贝粘蛋白mfp3-5在25℃下经0.1mo l/l的磷酸盐缓冲液处理6h，得到改性贻贝粘蛋白mfp3-5。

11、进一步地，所述pcr扩增使用的正向引物的核苷酸序列为5'-cgcggatccgacgacgacgacaagggttatggttattatccagg-3'，所述pcr扩增使用的反向引物的核苷酸序列为5'-ccgctcgagctaatacagatag-3'。

12、进一步地，所述诱导培养的诱导剂为0.5mmo l/l的iptg。

13、进一步地，所述缓冲液a由10mmo l/l咪唑、8mo l/l尿素、0.1mo l/l磷酸钠和10mmo l/l的tr i s-hcl组成，且所述缓冲液a的ph为7.9；

14、所述缓冲液b由30mmo l/l咪唑、8mo l/l尿素、0.1mo l/l磷酸钠和10mmo l/l的tri s-hcl组成，且所述缓冲液b的ph为6.3；

15、所述缓冲液c由0.3mo l/l咪唑、8mo l/l尿素、0.1mo l/l磷酸钠和10mmo l/l的tri s-hcl组成，且所述缓冲液c的ph为4.5。

16、进一步地，所述重组贻贝粘蛋白mfp3-5结构为包涵体结构。

17、进一步地，所述0.1mo l/l的磷酸盐缓冲液含有50μg/ml的酪氨酸酶和25mmo l/l抗坏血酸，且所述0.1mo l/l的磷酸盐盐缓冲液ph为7.0。

18、进一步地，所述改性多糖的制备方法包括以下步骤：

19、碱性多糖经等重量份的醋酸溶解后，加入0.2～0.5倍碱性多糖重量份的高碘酸钠混合，并在20～30℃下反应3～5h，反应结束后加去离子水进行混合搅拌，经离心处理得到沉淀，所述沉淀经真空干燥处理后得到所述改性多糖。

20、进一步地，所述碱性多糖包括壳聚糖，碱性多糖壳聚糖表面带有大量负电荷，借助壳聚糖上的负电荷效应与改性贻贝粘蛋白mfp3-5表面的正电荷效应形成静电吸附，进而促使形成交联网状结构，提升后续制备得到的复合固化液的粘结强度。

21、一种通过贻贝粘蛋白改性的无机骨粘合剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

22、将无机磷酸基化合物和缓冲液混合混合搅拌，直至无机磷酸基化合物全部溶解后，再加入复合固化液混合搅拌形成所述无机骨粘合剂。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果包括以下步骤：

24、(1)通过自然提取得到的贻贝粘蛋白产量极低(一万个活体贻贝大约只能提取1mg左右)，且价格昂贵，本发明通过利用基因重组技术，利用蛋白质包涵体的性质(不溶性，离心后易分离)，根据贻贝粘蛋白mfp3-5的cdna结构设计出特异性正反向引物，然后经pcr扩增合成后跟随载体进入受体细胞，经诱导剂处理得到大量含有重组贻贝粘蛋白mfp3-5的菌液，此时对菌液裂解处理后，溶出的蛋白质呈现包涵体形式，利于分离；重组技术得到的重组贻贝粘蛋白mfp3-5中的dopa含量低(0.25ng/μg)，难以有效发挥粘附作用，因此本发明通过使用包含有酪氨酸酶与抗坏血酸组成的磷酸盐缓冲体系对重组贻贝粘蛋白mfp3-5进行修饰处理，使得修饰获得的改性贻贝粘蛋白mfp3-5具有高含量的dopa(3.05ng/μg)，一方面通过基因重组技术提高重组贻贝粘蛋白mfp3-5的产量，另一方面，通过对重组得到的重组贻贝粘蛋白mfp3-5进行修饰处理，使得dopa含量得到有效提升，便于提高后续与改性壳聚糖形成的交联体系数量，使得制备得到的复合固化液具有良好的粘接性能与耐水性。

25、(2)通过氢键结合作用力形成的粘结剂，容易受到水分子的竞争性结合，从而削弱耐水性能，本发明一方面利用碱性多糖壳聚糖表面带有的大量负电荷与改性贻贝粘蛋白mfp3-5上的正电荷之间的静电吸附形成交联网状体系，另一方面通过对壳聚糖的氧化改性，使得壳聚糖获得醛基和羧基结构，醛基与改性贻贝粘蛋白mfp3-5上的亚氨基(-nh-)通过共价交联形成-c＝n-的网状结构，羧基结构与无机磷酸基化合物上的金属离子钙或镁，以阴阳离子键交联形成网状结构，通过多重交联网状结构，协同提高了无机磷酸基骨粘合剂的粘结强度和耐水性。