一种苦参碱半抗原、杂交瘤细胞株、抗体及其应用

本发明涉及食品安全免疫检测领域，尤其是指一种苦参碱半抗原、杂交瘤细胞株、抗体及其应用。

背景技术：

1、苦参碱(matrine)是由豆科植物苦参的根、茎、果实经乙醇等有机溶剂提取的一种生物碱，属于喹诺里西啶类的衍生物羽扇豆生物碱类。苦参碱具有多种生物活性，包括免疫调节、抗炎、抗菌、抗肿瘤等。它能够促进巨噬细胞吞噬和增强t淋巴细胞增殖，从而提高机体免疫力以对抗感染和疾病。此外，苦参碱还是一种天然的植物杀虫剂，能够防治蔬菜上菜青虫、菜蚜、瓜蚜、螟虫、瓢虫、果树上的天慕毛虫、刺蛾、蝽象等，粮食作物上粘虫、小麦吸浆虫和蝗虫等多种害虫。苦参碱对害虫具有触杀、胃毒作用，施用后可麻痹害虫的神经中枢系统，导致害虫窒息死亡。苦参碱作用的靶标大，能抑制抗药性的产生，对已经产生抗性的害虫仍有很强的活性。研究表明，长期摄入残留苦参碱的食品会引发腹痛、恶心、呕吐等胃肠道不适症状，出现头晕、胸闷、呼吸困难等情况，甚至可能会引起溶血反应，损害肝肾功能。

2、目前，针对苦参碱的检测方法主要为仪器检测，常用的有液相色谱法和液相色谱串联质谱法。仪器检测方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析苦参碱残留的检测方法。

3、酶联免疫法(elisa)是一种高效、灵敏的检测方法，检测时样本前处理过程简单检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，在农药残留分析中得到广泛应用。酶联免疫法检测的前提是得到对目标检测物具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，制备对苦参碱具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备抗苦参碱单克隆抗体，但在制备能分泌抗苦参碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备半抗原和完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出抗苦参碱单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种苦参碱半抗原、杂交瘤细胞株、抗体及其应用。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明第一个目的是提供一种苦参碱半抗原，所述苦参碱半抗原的结构式为：

4、

5、本发明第二个目的是提供所述的苦参碱半抗原的制备方法，包括以下步骤：

6、将槐果碱与4-氨基丁酸甲酯盐酸盐在碱性溶液中混合反应，得到苦参碱半抗原。所述碱性溶液为氢氧化钠；所述反应的条件为80℃下搅拌16h。

7、本发明第二个目的是提供一种苦参碱人工抗原，由所述的苦参碱半抗原与载体蛋白偶联得到。

8、在本发明的一些实施例中，所述载体蛋白选自钥鸡卵白蛋白、孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、乳铁蛋白、辣根过氧化物酶、甲状腺球蛋白、免疫球蛋白和激素中的至少一种。

9、本发明第三个目的是提供一株分泌苦参碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为cgmcc no.45902。

10、本发明第四个目的是提供一种苦参碱单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

11、本发明第五个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有所述的杂交瘤细胞株和/或所述的苦参碱单克隆抗体。

12、本发明第六个目的是提供一种苦参碱免疫检测试剂盒，所述苦参碱免疫检测试剂盒包含所述杂交瘤细胞株或所述苦参碱单克隆抗体。

13、在本发明的一些实施例中，所述苦参碱免疫检测试剂盒还包含偶联有信号物质的苦参碱或所述的苦参碱半抗原。

14、在本发明的一些实施例中，所述苦参碱免疫检测试剂盒还包含酶标板、苦参碱包被抗原、苦参碱标准液、酶标记二抗和底物反应液。

15、在本发明的一些实施例中，所述苦参碱包被抗原具有如下所示结构：

16、

17、本发明第七个目的是提供一种苦参碱检测胶体金试纸条，所述胶体金试纸条含有所述的杂交瘤细胞株、所述的苦参碱单克隆抗体和所述的组合物中的至少一种。

18、在本发明的一些实施例中，所述苦参碱检测胶体金试纸条，包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，所述胶体金结合垫上包被所述苦参碱单克隆抗体。所述检测线由苦参碱包被抗原印制得到。所述苦参碱包被抗原具有如下所示结构：

19、

20、本发明第八个目的是提供所述的杂交瘤细胞株、所述的苦参碱单克隆抗体、所述的组合物、所述的苦参碱免疫检测试剂盒或所述的苦参碱检测胶体金试纸条在检测苦参碱中的应用。

21、本发明分泌苦参碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：

22、(1)设计并制备苦参碱半抗原；

23、(2)制备苦参碱完全抗原，将获得的苦参碱完全抗原配制弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；

24、(3)将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入balb/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；

25、(4)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接elisa检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中苦参碱抗体含量高的获得免疫的小鼠；

26、(5)将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的苦参碱完全抗原进行；

27、(6)将进行冲刺免疫后的balb/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接elisa检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争elisa法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌苦参碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

28、在本发明的上述制备方法中，所述步骤(3)、(5)中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。

29、在本发明的上述制备方法中，所述步骤(3)、(5)中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。

30、在本发明的上述制备方法中，所述步骤3、5中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；

31、在本发明的上述制备方法中，所述步骤4中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。

32、在本发明的上述制备方法中，所述步骤6中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。

33、在本发明的上述制备方法中，所述步骤6中的细胞融合是通过聚乙二醇(peg4000)法进行的。

34、在本发明的上述制备方法中，所述步骤6中的培养基为rpmi-1640培养基。

35、在本发明的上述制备方法中，所述步骤6中的亚克隆次数为3次。

36、本发明的有益效果为：

37、本发明提供了一种苦参碱半抗原、杂交瘤细胞株、抗体及其应用。本发明提供了分泌苦参碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株4f12，该杂交瘤细胞株分泌产生的苦参碱单克隆抗体具有较好亲和力、较高的特异性和较高灵敏度(ic50值为0.39ng/ml)，可用于制备苦参碱的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，建立苦参碱的免疫学检测方法，为食品中苦参碱残留的检测提供有力的检测方法。

38、生物材料保藏：

39、一株分泌苦参碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株bont，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为cgmccno.45902。