检测马类常见传染性病原体的组合物、试剂盒及其用途的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及马类常见传染性病原体，如马链球菌马亚种、马脑脊髓炎病毒、马传染性贫血病毒、鼻疽杆菌、非洲马瘟病毒、马流产沙门氏菌的检测并进行区分的组合物和用途。

背景技术：

1、马腺疫(equine strangles，es)，也称为喷喉或喉骨胀，是由马链球菌马亚种(streptococcus equi subspecies equi，see)引起的一种急性传染病，主要影响马、驴和骡。典型症状包括体温升高、颌下淋巴结的急性化脓性炎症、以及上呼吸道咽黏膜的卡他性化脓性炎症。

2、马脑脊髓炎(equine encephalomyelitis，ee)，也称为borna病，是一种由马脑脊髓炎病毒(equine encephalitis viruses，eev)感染导致的人畜共患的病毒性疾病。这种疾病最初在1894年至1896年间在欧洲被发现，并随后在北美、南美、日本和苏联等地陆续出现不同类型的病毒性马脑脊髓炎，具有全球分布的特点。从健康影响的角度来看，该病主要导致患病动物中枢神经系统紊乱，出现兴奋或沉郁等症状，严重时会导致意识障碍。此外，患病动物还会出现明显的黄疸，胃肠迟缓和消化不良等症状。这些症状严重影响了马匹的生活质量和生产性能，甚至可能导致死亡。由于气候变化等因素，马脑脊髓炎的传播风险正在增加。例如，东部马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus，eeev)的活动在过去十年中有所增加，包括在人类和马匹群体中的大规模爆发。这一现象反映了病毒性疾病在气候变化背景下全球范围内的传播趋势，这对马脑脊髓炎的防控提出了挑战。

3、马传染性贫血(equine infectious anemia，eia)是一种由反转录病毒科慢病毒亚科(lentivirus)中的马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus，eiav)引起的传染病，主要影响马、骡和驴。该病的传播途径多样，包括昆虫叮咬(如虻、蚊、蠓等)、病马的排泄物、使用带有病毒的针头或其他设备。此外，不善的马匹管理、舍内潮湿、卫生条件差、过度劳累和寄生虫病感染也是导致此病高发的重要诱因。其临床特征主要为间歇热、贫血、出血、黄疸、心脏衰弱、浮肿、消瘦等。该疾病对马类动物的威胁性很大，尤其是急性马传染性贫血，有很高的致死率。

4、马鼻疽(glanders)是由假单胞菌属(pseudomonas)的鼻疽杆菌(pseudomonasmallei，pm)感染引起的一种严重人兽共患传染病，主要影响马、骡、驴等动物。临床症状为在鼻腔、喉头、气管粘膜或皮肤上形成鼻疽结节、溃疡和瘢痕，以及在肺、淋巴结或其它实质器官发生鼻疽性结节。马鼻疽可分为急性和慢性，急性马鼻疽可导致咳嗽、发烧和释放感染性鼻分泌物，随后出现败血症并在几天内死亡；慢性马鼻疽可导致鼻和皮下结节发展并最终溃烂，死亡时间在几个月内。根据法国阿尔福国立兽医学校记录，马鼻疽是马中最常见的疾病，也是最可能导致死亡的疾病。

5、非洲马瘟(african horse sickness，ahs)是一种由非洲马瘟病毒(africanhorse sickness virus，ahsv)引起的马属动物的急性传染病，主要通过库蠓等吸血昆虫叮咬传播。该病毒属于轮状病毒科orbivirus属，已识别出九种血清型。非洲马瘟有四种典型的临床表现形式：肺型、心型、混合型和马病热型。急性肺型只发生在完全易感的动物身上，病程短，死亡率高。心型水肿型病程较亚急性，死亡率可达50％。混合型急性型是最常见的，具有心型和肺型两种形式的特征，死亡率可达70％。感染初期可能出现高热、食欲不振、精神萎靡等症状，随后可能出现呼吸困难、皮肤和黏膜出现瘀斑等严重表现。由于其高致死率，非洲马瘟会对马匹相关产业造成重大损失，属于需要严格监控的病原体。

6、马副伤寒(equine paratyphoid，ep)是沙门氏菌病的一种，主要由马流产沙门氏菌(salmonella abortusequi，sae)感染马类所引起，表现为孕马流产，流产前大多有体温升高、乳房肿胀、阴道流出血色液体等先兆，快速检测该病原体以进行预防是马类相关行业的重点工作。

7、这6种常见的马传染性疾病病原体皆对马类相关畜牧业、农业、以及服务业有重大影响，但其中许多疾病无根治方法，主要以预防为主。由于致病病原体种类繁多，给疾病的诊断和预防带来巨大的挑战。因此，本领域需求一种能够简单、快速地检测上述病原体并且灵敏度高、特异性好的产品，有利于及时提供预防政策。

技术实现思路

1、有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测马类常见传染性病原体的组合物，包括检测如下马类常见传染性病原体中至少4种的上下游引物和探针：

2、如seq id no:1～3所示的检测马链球菌马亚种的上下游引物和探针；

3、如seq id no:4～6所示的检测马脑脊髓炎病毒的上下游引物和探针；

4、如seq id no:7～9所示的检测马传染性贫血病毒的上下游引物和探针；

5、如seq id no:10～12所示的检测鼻疽杆菌的上下游引物和探针；

6、如seq id no:13～15所示的检测非洲马瘟病毒的上下游引物和探针；或

7、如seq id no:16～18所示的检测马流产沙门氏菌的上下游引物和探针。

8、本发明提供的联检组合物，主要利用多重荧光pcr分析方法对马类常见传染性病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现马链球菌马亚种、马脑脊髓炎病毒、马传染性贫血病毒、鼻疽杆菌、非洲马瘟病毒、马流产沙门氏菌中至少4种病原体的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性策略。同时，本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/ml，检测更为准确，有利于及时提供预防政策。

9、进一步地，本发明提供一种检测马类常见传染性病原体的组合物，包括：

10、如seq id no:1～3所示的检测马链球菌马亚种的上下游引物和探针；

11、如seq id no:4～6所示的检测马脑脊髓炎病毒上下游引物和探针；

12、如seq id no:7～9所示的检测马传染性贫血病毒的上下游引物和探针；

13、如seq id no:10～12所示的检测鼻疽杆菌的上下游引物和探针；

14、如seq id no:13～15所示的检测非洲马瘟病毒的上下游引物和探针；以及

15、如seq id no:16～18所示的检测马流产沙门氏菌的上下游引物和探针。

16、进一步地，所述组合物包括检测内标的上下游引物及探针。

17、进一步地，本发明组合物不同探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

18、在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox、cy5以及cy5.5等，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

19、进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。

20、本发明的组合物可以任意组合成检测对应6个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。

21、举例来说，可以包括上述6对引物和探针中的任意5对，可以包括上述6对引物和探针中的任意4对，可以包括上述6对引物和探针中的任意3对，可以包括上述6对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述6对引物和探针中的任意1对。

22、在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。

23、在一个具体的实施方案中，马链球菌马亚种探针的荧光报告基团为fam；马脑脊髓炎病毒的探针的荧光报告基团为hex；马传染性贫血病毒探针的荧光报告基团为rox；鼻疽杆菌的探针的荧光报告基团为cy5；非洲马瘟病毒探针的荧光报告基团为atto 425；马流产沙门氏菌的探针的荧光报告基团为quasar705。

24、进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。

25、进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如mgb、dabcyl bhq-0、bhq1、bhq2或bhq3。

26、进一步地，所述组合物中单条引物的用量为0.2～0.5μm；所述组合物中单条探针的用量为0.06～0.2μm。

27、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

28、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

29、进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

30、第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测马类常见传染性病原体的试剂盒中的用途，其中，所述马类常见传染性病原体的类型为马链球菌马亚种、马脑脊髓炎病毒、马传染性贫血病毒、鼻疽杆菌、非洲马瘟病毒、马流产沙门氏菌。

31、第三方面，本发明提供了一种检测马类常见传染性病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

32、进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

33、在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是马链球菌马亚种、马脑脊髓炎病毒、马传染性贫血病毒、鼻疽杆菌、非洲马瘟病毒、马流产沙门氏菌的质粒、标准株或假病中的至少一种。

34、进一步地，所述试剂盒还包括核酸扩增试剂。

35、更进一步地，所述扩增试剂包括dntp(u)s、pcr缓冲液、逆转录酶、dna聚合酶、udg酶，以及mg2+中的至少一种。

36、更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂。

37、进一步地，所述dna聚合酶的浓度为3u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。所述逆转录酶的浓度为6u/反应～10u/反应，例如逆转录酶可以是neoscript rt酶；所述ung酶的浓度为0.4u-2u/反应。

38、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：taq酶、逆转录酶、ung酶、mg2+、dntp(u)s、引物、探针和pcr缓冲液。

39、pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton x-100等组分构成。一般单个pcr反应管中总体积为20μl～200μl。

40、第四方面，提供了一种用于检测马类常见传染性病原体的方法，所述方法包括以下步骤：

41、1)提取待测样本的核酸；

42、2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；

43、3)获得并分析结果。

44、在本发明中，用于检测的样本可以是鼻拭子、阴道拭子、脑脊液、粪便、血清、血液等，但不限于此。

45、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

46、cdna逆转录和ung酶反应，温度为50～65℃，时间为10～15分钟，1次循环；taq酶活化，温度为90～99℃，时间为5～120秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

47、在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测马类常见传染性病原体的方法，所述方法包括以下步骤：

48、1)提取待测样本的核酸；

49、2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；

50、3)获得并分析结果。

51、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

52、cdna逆转录和ung酶反应，温度为50～65℃，时间为10～15分钟，1次循环；taq酶活化，温度为90～99℃，时间为5～120秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

53、在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物用于制备检测马类常见传染性病原体的试剂的用途，所述检测以下步骤：

54、1)提取待测样本的核酸；

55、2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；

56、3)获得并分析结果。

57、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

58、cdna逆转录和ung酶反应，温度为50～65℃，时间为10～15分钟，1次循环；taq酶活化，温度为90～99℃，时间为5～120秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。