一种壳聚糖酶突变体及其应用的制作方法

本发明属于酶工程和生物，具体涉及一种壳聚糖酶突变体及其应用。

背景技术：

1、壳聚糖(chitosan)，一种通过对甲壳素强碱处理或部分脱乙酰化后获得的线性多糖，其脱乙酰度超过50％。它也是由β-1,4-n-乙酰氨基葡萄糖单元(glcnac)和d-氨基葡萄糖(glcn)通过1,4-糖苷键交替连接而成，是自然界中唯一已知的天然碱性多糖。壳聚糖独特的理化特性，如良好的生物相容性、生物降解性和低毒性，开启了其在多个领域的广泛应用前景。值得一提的是，壳聚糖可通过水解工艺进一步转化为生物活性更强的低分子量衍生物。

2、ding等对壳聚糖酶sscsn46进行了缺失突变，使其能够更好地适应底物，从而优选产生壳五糖。li等通过合理设计壳聚糖酶csnmy002的结构，发现其在处理壳六糖时采用了“4+2”裂解策略。他们设计出了csnmy002-g21k突变体，能够高效产生壳二糖。wang等对壳聚糖酶gscsn46a进行了研究，发现其亚位点中存在两个新的结合位点，并成功实现了对壳寡糖产物dp的控制。这些研究证明了通过分子修饰靶向壳聚糖酶可以控制壳寡糖产物的可行性，不仅拓宽了壳聚糖酶的适用范围，还实现了酶法制备壳寡糖的可控水解。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种壳聚糖酶突变体。

2、为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种壳聚糖酶突变体，其氨基酸序列如seq id no：1所示。

4、本发明的第二目的在于提供编码上述壳聚糖酶突变体的核苷酸序列。

5、本发明的第三目的在于提供包含上述核苷酸序列的重组载体。

6、作为一种优选的实施方式，选用pet-22b质粒构建所述重组载体。

7、本发明的第四目的在于提供包含上述重组载体的工程菌株。

8、作为一种优选的实施方式，选用大肠杆菌作为宿主菌构建所述工程菌株。

9、本发明的第五目的在于提供上述壳聚糖酶突变体在水解壳聚糖中的应用。

10、作为一种优选的实施方式，水解壳聚糖的温度为35℃-55℃。

11、作为一种优选的实施方式，水解壳聚糖的ph为5.0-7.0。

12、作为一种优选的实施方式，将所述壳聚糖配制为胶体壳聚糖后，加入所述壳聚糖酶突变体的纯化酶液/粗酶液进行水解反应。

13、作为一种优选的实施方式，利用醋酸钠溶液将所述壳聚糖配制为胶体壳聚糖。

14、作为一种优选的实施方式，所述胶体壳聚糖浓度为0.5-1.5％(w/v)。

15、本发明通过对现有壳聚糖酶csnb进行结构分析，认为壳聚糖酶底物结合的(-2)亚位点对glcn结合具有决定性的偏好，因此将csnb中第116个点位的氨基酸残基pro突变为ala，构建得到突变体p116a。突变体p116a增加了对壳聚糖的水解活性，使用突变酶进行降解壳聚糖反应，可以使降解壳聚糖反应的产量提升，具有良好的工业应用价值。此外，突变体p116a的产物结构中壳三糖含量达到60％，可利用突变体p116a水解壳聚糖制备壳三糖。

技术特征：

1.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：1所示。

2.编码权利要求1所述壳聚糖酶突变体的核苷酸序列。

3.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组载体。

4.包含权利要求3所述重组载体的工程菌株。

5.权利要求1所述壳聚糖酶突变体在水解壳聚糖中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，水解壳聚糖的温度为35℃-55℃。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，水解壳聚糖的ph为5.0-7.0。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述壳聚糖配制为胶体壳聚糖后，加入所述壳聚糖酶突变体的纯化酶液/粗酶液进行水解反应。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，利用醋酸钠溶液将所述壳聚糖配制为胶体壳聚糖。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述胶体壳聚糖浓度为0.5-1.5%（w/v）。

技术总结本发明涉及一种壳聚糖酶突变体及其应用，所述壳聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过蛋白质结构模拟与已知结构进行比较，在CsnB的不同亚位点上进行点突变，获得突变体P116A，突变体P116A因为新形成的π键的作用使酶活提高至106.94%，产物中壳三糖的比例也增加至60%，具有良好的工业应用价值。技术研发人员：柏鹏飞,刘伟,章熙东受保护的技术使用者：南京外国语学校技术研发日：技术公布日：2024/11/4