经修饰的细胞及其用途的制作方法

本公开一般涉及修饰的细胞，更具体地涉及膜蛋白修饰的细胞及其用于递送物质的用途，所述物质包括药物和探针等，特别是用于治疗和预防与hpv感染相关的疾病的用途。

背景技术：

1、人乳头瘤病毒感染(hpv感染)是由人乳头瘤病毒(hpv)(属于乳头状瘤病毒科(papillomaviridae)的dna病毒)引起的感染。许多hpv感染没有症状，并且90％的感染会在两年内自行痊愈。然而，在某些情况下，hpv感染会持续存在并导致疣或癌前病变。根据感染的部位不同，这些病变会增加宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌、口腔癌、扁桃体癌或喉癌的风险。

2、绝大多数的宫颈癌都是由hpv引起的；其中hpv16和hpv18这两株占所有病例的70％。将近90％的hpv阳性的口咽癌与hpv16有关。hpv6和hpv11是生殖器疣和喉乳头状瘤病的常见病因。hpv16引发了50％的宫颈癌和癌前宫颈病变。宫颈癌是全球女性中第四常见的癌症。然而，对于复发性宫颈癌患者，治疗选择有限。根据世界卫生组织(who)发布的全球癌症流行病学统计报告，2020年全球约有60万例宫颈癌新发病例和34万例宫颈癌死亡病例，其中约85％的新发病例和90％的死亡病例发生在发展中国家。2020年，中国有11万例宫颈癌新发病例，约占全球宫颈癌新发病例的18.3％，有6万例死亡病例，约占全球宫颈癌死亡病例的17.6％。

3、人类有效的抗肿瘤免疫与针对癌症新抗原的t细胞的存在有关，癌症新抗原是一类由肿瘤特异性突变产生的hla结合肽。新出现的数据表明，对此类新抗原的识别已成为临床上免疫疗法的一个主要方面。大规模并行全外显子组测序已用于检测肿瘤内的所有突变以预测新抗原。新抗原疫苗接种可以扩大已有新抗原特异性t细胞群体并诱导新的肿瘤特异性t细胞。尽管新抗原已成为抗肿瘤免疫反应的潜在理想靶标，但在临床应用实现之前，仍有许多问题尚待解答。t细胞的激活需要mhc分子向特定t细胞受体呈递mhc限制性肽。特定抗原呈递系统的缺乏是新抗原疫苗接种的问题之一。

4、近年来，用于延长在治疗多种人疾病中药物保留时间的药物递送系统的开发引起了广泛关注。然而，许多系统仍然面临各种挑战和限制，例如稳定性差、不想要的毒性和免疫反应[j.w.yoo,d.j.irvine,d.e.discher,and s.mitragotri,“bio-inspired,bioengineered and biomimetic drug delivery carriers,”nat.rev.drug discov.,vol.10,no.7,pp.521-535,2011.]。红细胞(rbc)是人体内最常见的细胞类型，三十多年来作为理想的体内药物递送系统已被广泛研究，原因是其独特的生物学特性，包括：(i)循环范围广泛遍及全身；(ii)作为生物材料具有良好的生物相容性，体内存活时间长；(iii)大的表面积与体积比；(iv)没有细胞核、线粒体和其他细胞器。

5、通过直接封装、外源肽的非共价连接、或通过与rbc表面蛋白特异性抗体的融合来安装蛋白质，rbc已被开发为药物递送载体。已经证明这种修饰的rbc的体内应用存在局限性。例如，封装会破坏细胞膜，从而影响仅工程改造的细胞的体内存活率。此外，聚合物颗粒与rbc的非共价连接容易解离，有效载荷将很快在体内降解。

6、细菌分选酶是能够以共价和位点特异性方式修饰蛋白质的转肽酶[j.m.antos,j.ingram,t.fang,n.pishesha,m.c.truttmann,and h.l.ploegh,“site-specificprotein labeling via sortase-mediated transpeptidation,”2017.]。来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的野生型分选酶a(wt srta)识别lpxtg基序，并在苏氨酸和甘氨酸之间进行切割，在酶和底物蛋白之间形成共价酰基酶中间体。该中间体通过n-末端通常具有三个连续甘氨酸残基(3×甘氨酸，g3)的肽或蛋白质的亲核攻击而解离。先前的研究已经在rbc上基因过表达了kell膜蛋白，该膜蛋白在其c-末端具有lpxtg基序，通过使用wt srta，可以将其连接到3×甘氨酸或g(n≥3)修饰的蛋白质/肽的n-末端[j.shi,l.kundrat,n.pishesha,a.bilate,c.theile,and t.maruyama,“engineered red bloodcells as carriers for systemic delivery of a wide array of functionalprobes,”pp.1-6,2014.]。这些携带药物的rbc在动物模型中显示出治疗疾病的功效。然而，这需要工程改造造血干细胞或祖细胞(hspc)并将这些细胞分化为成熟rbc的步骤，这极大地限制了应用。

7、因此，在本领域仍然需要一种改进的细胞递送系统用于治疗与hpv感染相关的疾病。

技术实现思路

1、在第一方面，本公开提供了一种细胞，所述细胞具有与其连接的物质，其中所述物质通过分选酶识别基序与所述细胞的至少一种膜蛋白连接，并且连接到至少一种膜蛋白的物质包含以下结构：a-m-l-glymxn-m-p，其中a代表物质，l代表分选酶介导的反应后分选酶识别基序的残余部分，glym代表m个甘氨酸，其中m优选为1-5，xn代表n个间隔氨基酸，其中n优选为0-10，m代表交联后双功能交联剂的残余部分，p代表细胞的至少一种膜蛋白。

2、在一些实施方案中，双功能交联剂是胺-巯基型，优选马来酰亚胺羧酸(c2-8)，例如，6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸。

3、在一些实施方案中，双功能交联剂使所述侧链氨基与至少一种膜蛋白的至少一个暴露的巯基形成交联。

4、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含、或基本上由、或由选自lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta的氨基酸序列组成，其中x是任何氨基酸。

5、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含位于分选酶识别基序的n-末端至c-末端方向第5位的非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是任选取代的羟基羧酸，其具有式ch2oh-(ch2)n-cooh，其中n为0至3的整数，优选n＝0。

6、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含、或基本上由、或由选自lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y的氨基酸序列组成，其中*代表任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。

7、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含、或基本上由、或由选自lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a的氨基酸序列组成，其中m优选为lpet*g，*为2-羟基乙酸。

8、在一些实施方案中，l选自lpxt、lpxa、lpxs、lpxl、lpxv、lgxt、laxt、lsxt、npxt、mpxt、ipxt、spxt、vpxt和ypxr，其中x是任何氨基酸。

9、在一些实施方案中，物质a包含暴露的巯基，优选暴露的半胱氨酸，更优选末端半胱氨酸，最优选c末端半胱氨酸。

10、在一些实施方案中，物质从n-末端至c-末端包含hpv抗原肽、任选的第一肽接头和mhc-i。在一些另外的实施方案中，物质从n-末端至c-末端包含hpv抗原肽、任选的第一肽接头、β2-微球蛋白(例如人β2-微球蛋白)、任选的第二肽接头和mhc-i重链(优选缺失跨膜区和胞质区的mhc-i重链)。

11、在一些实施方案中，hpv抗原肽与主要组织相容性复合物ⅰ类(mhc-i)蛋白结合，如hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:06、hla-a*02:07和hla-a*02:11。

12、在一些实施方案中，hpv抗原肽是hpv16抗原肽，优选包含或由选自seq id no:9(ymldlqpet)、seq id no:10(llmgtlgiv)和seq id no:11(kclkfyski)的氨基酸序列组成，或其功能等效的变体。

13、在一些实施方案中，分选酶是分选酶a(srta)，例如，金黄色葡萄球菌转肽酶a，例如，金黄色葡萄球菌转肽酶a变体(mgsrta)。

14、在一些实施方案中，细胞选自去核细胞，优选红细胞。

15、在第二方面，本公开提供了一种修饰细胞的方法，包括：

16、a)提供包含a-m-l'结构的分选酶底物，其中a代表物质，l'代表分选酶识别基序，m代表交联后双功能交联剂的残余部分；

17、b)(i)提供具有式glymxn-m'的肽，其中glym代表m个甘氨酸，m优选为1-5；xn代表n个间隔氨基酸，n优选为0-10；m'代表双功能交联剂；

18、(ii)在使glymxn-m'肽与细胞的至少一种膜蛋白连接从而生成glymxn-m-p的条件下，用glymxn-m'肽处理细胞，其中m代表交联后双功能交联剂的残余部分，p代表所述细胞的至少一种膜蛋白；和

19、c)在一种或多种适合于分选酶通过分选酶介导的反应将分选酶底物缀合至glym的条件下，将处理的细胞与分选酶底物在分选酶存在下进行接触；

20、a)和b)可以同时，或者a)在b)之前，或者a)在b)之后进行。

21、在一些实施方案中，在处理步骤之前，所述方法进一步包括用还原剂对细胞进行预处理以形成暴露的巯基的步骤。

22、在一些实施方案中，双功能交联剂是胺-巯基型，优选马来酰亚胺羧酸(c2-8)，例如，6-马来酰亚胺己酸和4-马来酰亚胺丁酸。

23、在一些实施方案中，xn包含至少一个具有侧链氨基的氨基酸，例如赖氨酸，并且优选地，xn的c-末端氨基酸是具有侧链氨基的氨基酸。

24、在一些实施方案中，双功能交联剂交联所述侧链氨基和至少一种膜蛋白的至少一个暴露的巯基。

25、在一些实施方案中，分选酶介导的反应形成连接到细胞的至少一种膜蛋白的物质，所述物质包含以下结构：a-m-l-glymxn-m-p，其中a代表物质，l代表分选酶介导反应后分选酶识别基序的残留部分，glym代表m个甘氨酸，m优选为1-5，xn代表n个间隔氨基酸，n优选为0-10，m代表交联后双功能交联剂的残留部分，p代表细胞的至少一种膜蛋白。

26、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含、或基本上由、或由选自lpxtg、lpxag、lpxsg、lpxlg、lpxvg、lgxtg、laxtg、lsxtg、npxtg、mpxtg、ipxtg、spxtg、vpxtg、ypxrg、lpxts和lpxta的氨基酸序列组成，其中x是任何氨基酸。

27、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含位于分选酶识别基序的n-末端至c-末端方向第5位的非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸是任选取代的羟基羧酸，其具有式ch2oh-(ch2)n-cooh，其中n为0至3的整数，优选n＝0。

28、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含、或基本上由、或由选自lpxt*y、lpxa*y、lpxs*y、lpxl*y、lpxv*y、lgxt*y、laxt*y、lsxt*y、npxt*y、mpxt*y、ipxt*y、spxt*y、vpxt*y和ypxr*y的氨基酸序列组成，其中*代表任选取代的羟基羧酸；并且x和y独立地代表任何氨基酸。

29、在一些实施方案中，分选酶识别基序包含、或基本上由、或由选自lpxt*g、lpxa*g、lpxs*g、lpxl*g、lpxv*g、lgxt*g、laxt*g、lsxt*g、npxt*g、mpxt*g、ipxt*g、spxt*g、vpxt*g、ypxr*g、lpxt*s和lpxt*a的氨基酸序列组成，其中m优选为lpet*g，*为2-羟基乙酸。

30、在一些实施方案中，物质a包含暴露的巯基，优选暴露的半胱氨酸，更优选末端半胱氨酸，最优选c末端半胱氨酸。

31、在一些实施方案中，物质从n-末端至c-末端包含hpv抗原肽、任选的第一肽接头和mhc-i。在一些另外的实施方案中，物质从n-末端至c-末端包含hpv抗原肽、任选的第一肽接头、β2-微球蛋白(例如人β2-微球蛋白)、任选的第二肽接头和mhc-i重链(优选缺失跨膜区和胞质区的mhc-i重链)。

32、在一些实施方案中，hpv抗原肽与主要组织相容性复合物ⅰ类(mhc-i)蛋白结合，如hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:06、hla-a*02:07和hla-a*02:11。

33、在一些实施方案中，hpv抗原肽是hpv16抗原肽，优选包含或由选自seq id no:9(ymldlqpet)、seq id no:10(llmgtlgiv)和seq id no:11(kclkfyski)的氨基酸序列组成，或其功能等效的变体。

34、在一些实施方案中，分选酶是分选酶a(srta)，例如，金黄色葡萄球菌转肽酶a，例如，金黄色葡萄球菌转肽酶a变体(mgsrta)。

35、在一些实施方案中，细胞选自去核细胞，优选红细胞。

36、在第三方面，本公开提供了通过第二方面的方法获得的细胞。

37、在第四方面，本公开提供了包含第一和/或第三方面的细胞和任选地生理学上可接受的载体的组合物。

38、在第五方面，本公开提供了用于诊断、治疗或预防与hpv感染相关的疾病的方法。

39、在一些实施方案中，与hpv感染相关的疾病选自宫颈癌、肛门生殖器癌症、头颈癌和口咽癌。

40、在第六方面，本公开提供了将物质递送至有需要的受试者的方法，包括向受试者施用第一和/或第三方面的细胞或第四方面的组合物。

41、在第七方面，本公开提供了一种增加受试者中物质的循环时间或血浆半衰期的方法，包括根据第二方面的方法将物质与细胞连接。

42、在第八方面，本发明提供了第一和/或第三方面的细胞或第四方面的组合物在制备用于诊断、治疗或预防与hpv感染相关的疾病的药物中的用途。

43、在一些实施方案中，与hpv感染相关的疾病选自宫颈癌、肛门生殖器癌症、头颈癌和口咽癌。

44、在一些实施方案中，药物是疫苗。

45、在第九方面，提供了第一和/或第三方面的细胞或第四方面的组合物用于在有需要的受试者中诊断、治疗或预防与hpv感染相关的疾病。

46、在一些实施方案中，与hpv感染相关的疾病选自宫颈癌、肛门生殖器癌症、头颈癌和口咽癌。