一种双特异性抗体及其用途的制作方法

本公开涉及一种双特异性抗体及其用途，特别是结合cd3及另一种抗原的双特异性抗体及其用途。

背景技术：

1、t细胞双特异抗体(或称t细胞衔接器)，是一种特殊的抗体分子，可通过其一端识别靶细胞表面抗原(抗原臂)，通过另一端结合t细胞cd3受体(cd3臂)，以一种类似于tcr/肽/hla的方式，使t细胞上的cd3发生聚集，从而活化t细胞并杀伤肿瘤。上世纪80年代，即有报道利用双特异抗体杀伤肿瘤细胞(nature.1985apr 18-24；314(6012):628-31；nature.1985jul 25-31；316(6026):354-6)。经过30多年的研究，基本解决了抗体的错配问题，有3个双特异抗体药物陆续获得批准上市。尽管在批准的适应症中显示了非常好的疗效，但随之带来的副作用和使用上的局限性，阻碍了早期这些双特异抗体的广泛应用。例如：早期上市的catumaxomab由于fc段与肝脏kupffer细胞表达的fcγ受体结合，引发了快速的细胞因子释放，目前已退市；而2014年上市的blinatumomab，由于采用fv抗体片段，生物半衰期仅为2小时，需低剂量持续静脉输注，同时fda批准伴有细胞因子释放综合症和神经毒性的黑框警告。

2、正常免疫应答过程中，tcr以低亲和力(约1-100μm)结合感染或突变细胞上的外源肽-人白细胞抗原复合物(hla)，通过cd3信号传导复合物(包括cd3εγ、cd3εδ和cd3ζζ)，将活化信号传导到核内，激活转录因子及其下游蛋白(细胞因子、颗粒酶、穿孔素等)的表达，其中tcr复合物产生的信号强度将决定t细胞的命运。早期开发的cd3双特异抗体，多基于okt3、l2k、ucht1和tr66等少数鼠源抗体，亲和力较高，导致t细胞过度活化，释放大量细胞因子，产生细胞因子风暴综合征；同时，高亲和力也会导致双特异抗体在二级淋巴器官的富集，减低在肿瘤组织的暴露。

3、抗体fc部分与fcγ受体的结合能力是另一个对影响药物安全的重要因素，由于fcγ受体在多种正常组织表达，双特异抗体通过fc与细胞膜上的fcγ受体结合后，可导致另一端结合的cd3受体因fcγ受体聚集而交联活化，从而产生严重的脱靶毒性。通过使用fcγ受体结合能力较弱的人igg2亚型或igg4亚型，或者进一步在ch2相应位点进行氨基酸替换，如：armour等将igg1和igg4的第233-236位点(eu序列编号)替换成igg2相应序列，减少了和fcγ受体的结合(eur.j.immunol.1999)，newman等在igg4引入突变ser228pro和leu235glu，稳定igg4结构同时减少与fcγ受体的结合(clin immunol.2001)，idusogie等发现将asp270、lys322、pro329或pro331分别替换成ala，可减少igg1与补体c1q的结合(jimmunol.2000)等。

4、链间错配是天然igg样双特异抗体开发的主要工艺难点。merchant am等发明的共同轻链(1998)，或fischer n等开发的共同重链(2015)，通常都需要进行复杂的蛋白质工程改造，或者利用转基因动物产生(mcwhirter j，2012)；carter p等(1997)通过在抗体fc段引入knobs-into-holes互补突变，以解决重链间的错配；schaefer g等(2011)开发了将轻、重链的fab部分或全长进行交换的crossmab技术，解决轻链错配问题，其中部分交换的crossmabvh-vl和crossmabch1-cl需要引入额外肽段以实现正确配对，而fab全长交换的crossmabfab正确配对率不足50％。

技术实现思路

1、在表达双特异抗体的过程中，本发明人意外发现，将具有λ轻链的人源化cd3抗体和具有κ轻链的靶向抗体进行组合，cd3抗体λ轻链更倾向于和同源的cd3重链进行配对，而靶向抗体kappa轻链倾向于和同源的靶向抗体重链配对。通过进一步在轻、重链间设计互补电荷对，可以提高正确配对效率。并且，实验证明，利用cd20、bcma和gpc3等多个靶点抗体和人源化cd3抗体构建的新型t细胞连接器，经三步纯化均实现98-100％的单体纯度，错配比例极低(<1％)。

2、本公开提供了一种新型t细胞连接器，采用不同类型轻链κλ双特异抗体设计，和全长igg构型，其中：结合靶细胞和t细胞cd3的抗体臂分别采用kappa轻链和lambda轻链，与其同源的重链进行配对，同时引入互补电荷对增强正确配对率；通过亲和力优化，新型t细胞连接器低浓度下即可募集活化t细胞，对靶细胞产生有效杀伤，无靶细胞存在时不激活t细胞；同时，新型t细胞κλ双特异抗体不与fcγr受体结合，减低了产生细胞因子风暴的风险。采用本公开方法构建的新型cd20×cd3κλ双特异抗体、bcma×cd3κλ双特异抗体和gpc3xcd3κλ双特异抗体纯化收率高，通过三步法纯化可实现>99％纯度。动物对新型cd20-cd3κλ双特异抗体耐受良好，新型t细胞连接器的疗效和安全性均优于同类抗体。

3、因此，在一方面，本公开提供了一种双特异性抗体或其抗原结合部分。

4、在一方面，本公开提供了编码如前述方面的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸。

5、在一方面，本公开提供了包含前述方面的核酸的载体。

6、在一方面，本公开提供了包含前述方面的载体的细胞。

7、根据前述任一方面的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是人源化的。

8、在一方面，本公开提供了包含如前述任一方面的抗体或其抗原结合部分或其编码核酸和药学上可接受的载体的药物组合物或试剂盒。

9、在一方面，本公开提供了包含共价附着至治疗部分的前述任一方面所述的抗体或其抗原结合部分、双特异性或多特异性分子的抗体-药物偶联物。

10、在一方面，本公开提供了治疗与相关病症的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施用治疗有效量的前述任一方面的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞和/或药物组合物。

11、在一方面，本公开提供了前述任一方面的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞和/或药物组合物在制备用于治疗哺乳动物中与肿瘤抗原相关病症的药物或试剂盒中的用途。

12、本公开的抗体可以用于多种应用，包括检测肿瘤抗原，诊断、治疗或预防与肿瘤抗原相关的疾病。

技术特征：

1.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第二抗原为cd3抗原；

3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一抗原结合部分的第一轻链可变区具有gln43lys突变(vκgpc3:gln43lys)；所述第一抗原结合部分的第一重链可变区具有gln39glu突变(vhgpc3:gln39glu)。

4.根据权利要求1-3任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一结合结构域包含氨基酸序列seq id no:126或其任何变体的第一轻链可变区；和氨基酸序列seq id no:128或其任何变体的第一重链可变区。

5.根据权利要求1-4任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第一抗原结合部分的第一轻链选自氨基酸序列seq id no:88和92；和/或所述第一抗原结合部分的第一重链选自氨基酸序列seq id no:90和94；

6.根据权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第二抗原结合部分的第二轻链可变区具有gln40glu突变(vλcd3:gln40glu)；所述第二抗原结合部分的第二重链可变区具有gln39lys突变(vhcd3:gln39lys)。

7.根据权利要求1-6任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第二结合结构域包含氨基酸序列seq id no:18或其任何变体的第二轻链可变区；和氨基酸序列seq id no:50或其任何变体的第二重链可变区；

8.根据权利要求1-7任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述第二抗原结合部分的第二轻链为氨基酸序列seq id no:58；和所述第二抗原结合部分的第二重链为氨基酸序列seq id no:60；或者

9.根据权利要求1-8任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，所述双特异抗体的第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分还具有ser228pro、leu235glu和/或pro329ala突变。

10.编码根据权利要求1-9任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸。

11.根据权利要求10所述的核酸，其中，所述第一抗原结合部分的第一轻链可变区的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:127；和/或所述第一抗原结合部分的第一重链可变区的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:129。

12.根据权利要求10或11所述的核酸，其中，所述第二抗原结合部分的第二轻链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:19；所述第二抗原结合部分的第二重链可变区的编码核酸为核苷酸序列seq id no:51；

13.根据权利要求10-12任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸，其中，所述第一抗原结合部分的第一轻链的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:89和93；和/或所述第一抗原结合部分的第一重链的编码核酸选自核苷酸序列seq id no:91和95；

14.根据权利要求10-13任一项所述的核酸，其中，所述第二抗原结合部分的第二轻链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:59，和所述第二抗原结合部分的第二重链的编码核酸为核苷酸序列seq id no:61；或者

15.含有权利要求10-14任一项所述核酸的载体。

16.含有权利要求10-14任一项所述的核酸或权利要求15所述载体的细胞。

17.一种组合物，其包含权利要求1-9任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分、权利要求10-14任一项所述的核酸、权利要求15所述的载体和/或权利要求16所述的细胞。

18.一种抗体-药物偶联物，其包含共价附着至治疗部分的权利要求1-9任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分。

19.根据权利要求18所述的抗体-药物偶联物，其中，所述治疗部分为细胞毒性部分、化疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、免疫刺激剂、裂解肽或放射性同位素。

20.根据权利要求19所述的抗体-药物偶联物，其中，所述细胞毒性部分选自以下：紫杉醇；细胞松弛素b；短杆菌肽d；溴化乙锭；吐根碱；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷；长春新碱；长春碱；秋水仙碱；多柔比星；柔红霉素；二羟基蒽二酮；微管蛋白抑制剂；抗有丝分裂剂；海兔毒素10或15；伊立替康；米托蒽醌；光辉霉素；放线菌素d；1-脱氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛尔；嘌呤霉素；卡奇霉素或；抗代谢药；烷化剂；铂类衍生物；多卡霉素a、多卡霉素sa、雷切霉素(cc-1065)；抗生素；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(pdb)；白喉毒素及相关分子、蓖麻毒素、霍乱毒素、志贺样毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆bowman-birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、阿罗林、皂草素、蒴莲根毒素、胶凝蛋白、相思豆毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-sarcin、油桐(aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂霉素、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素毒素；核糖核酸酶(rnase)；dnase i、葡萄球菌内毒素a；商陆抗病毒蛋白；白喉毒素和假单胞菌内毒素；

21.根据权利要求20所述的抗体-药物偶联物，其中，

22.一种试剂盒，其含其包含权利要求1-9任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分、权利要求10-14任一项所述的核酸、权利要求15所述的载体、或权利要求16所述的细胞、权利要求17所述的组合物和/或权利要求18-21任一项所述的抗体-药物偶联物。

23.含权利要求1-9任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分、权利要求10-14任一项所述的核酸、权利要求15所述的载体、或权利要求16所述的细胞、权利要求17所述的组合物和/或权利要求18-21任一项所述的抗体-药物偶联物在制备用于诊断、治疗或预防与肿瘤抗原相关疾病药物或试剂盒中的用途。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述肿瘤抗原为gpc3，所述肿瘤抗原相关疾病为与gpc3相关疾病；与gpc3相关的疾病包括肿瘤为gpc3阳性肝癌、gpc3阳性肝细胞癌、gpc3阳性胰腺癌、gpc3阳性肺癌、gpc3阳性结肠癌、gpc3阳性乳腺癌、gpc3阳性前列腺癌、gpc3阳性白血病或gpc3阳性淋巴瘤。

技术总结本公开涉及生物医药技术领域，提供了一种双特异性抗体及其用途。所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含：(a)第一抗原结合部分或其抗原结合片段，所述第一抗原结合部分包含第一轻链和第一重链，所述第一轻链为κ型轻链，所述第一抗原结合部分包含与第一抗原结合的第一结合结构域,所述第一抗原为GPC3抗原；和(b)第二抗原结合部分或其抗原结合片段，所述第二抗原结合部分包含第二轻链和第二重链，所述第二轻链为λ型轻链，所述第二抗原结合部分包含与第二抗原结合的第二结合结构域。所述双特异抗体的重链和轻链的错配率低，纯化收率高，且不与FcγR受体结合，减低了产生细胞因子风暴的风险，耐受良好，其疗效和安全性均优于同类抗体。技术研发人员：陈博,徐刚,王常玉受保护的技术使用者：康诺亚生物医药科技（成都）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4