与小麦直链淀粉含量显著关联的分子标记KASP-SBEIIa-D及其应用

本发明涉及小麦育种，特别是涉及与小麦直链淀粉含量显著关联的分子标记kasp-sbeiia-d及其应用。

背景技术：

1、小麦(triticum aestivum l.)是全世界主要的粮食作物之一，全球约40％的人口以小麦为主粮。淀粉是成熟小麦籽粒的主要组成部分，约占籽粒胚乳的70％～80％。根据多糖链的形式，小麦淀粉分可为直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)，二者的比例约为1:3。这两种主要淀粉的比例、精细结构以及直链淀粉含量决定了淀粉的理化性质以及产品的最终品质。前人研究表明直链淀粉含量与抗性淀粉含量呈显著性正相关，而抗性淀粉具有较好的生理功能，如预防糖尿病、抗消化以及利于肠道健康等。因此，可以通过提高小麦中直链淀粉含量来提高抗性淀粉的含量，从而开发具备保健功效的小麦保健型食品。此外，直链淀粉还具有持水力低、吸水性差、可膨化、糊化温度高、热量低等特点，适合用于食品直接加工或作为食品添加剂。直链淀粉还可以形成塑性较好的薄膜，作为重要的工业原料。但目前生产上推广种植的小麦品种直链淀粉含量普遍偏低。因此，筛选和创制高直链淀粉含量的小麦种质材料对功能性小麦新品种的培育具有重要意义。

2、小麦胚乳中淀粉的合成发生在淀粉体内，合成过程复杂，需要多种酶共同参与，主要有adp-葡萄糖焦磷酸化酶(agpase)、淀粉合成酶(ss)(包括颗粒结合型淀粉合成酶(gbss)和可溶性淀粉合成酶(sss))、淀粉分支酶(sbe)、淀粉脱分支酶(dbe)、淀粉磷酸化酶(pho)和歧化酶(dpe)。淀粉分支酶(sbe)可以催化α-1,4糖苷键发生断裂，并将切下的寡聚糖链通过α-1,6糖苷键连接，产生淀粉分支链。sbe可以影响谷物胚乳的精细结构。除控制支链淀粉合成外，由于直链淀粉同样具有少量的分支结构，这就需要sbe在直链淀粉合成过程中同样表现活跃。小麦中主要有两类sbe：sbei和sbeii，其中sbeii具有两个主要的同工酶，即sbeiia和sbeiib。sbeiia是小麦胚乳中可溶性相中的主要异构体，在确定小麦籽粒中直连淀粉和支链淀粉的比例方面起主要作用。sestili等人使用rnai靶向sbeiia基因发现直链淀粉含量大幅增加。

3、slade等人(2012)利用tilling技术在面包小麦tabeiia基因的a、b、d亚基因组上分别识别出一个stopgain突变位点。这三个stopgain突变位点分别位于a亚基因组5267bp处，g突变为a；b亚基因组5039bp处，g突变为a；d亚基因组5202bp处，g突变为a。slade通过将含有这三个位点的小麦材料通过杂交使三个突变等位基因结合，获得了纯合突变系。slade认为相关位点的突变可导致rna剪接异常以及随后改变或截短蛋白质的翻译。li等人(2019)研究发现错义突变仅影响单个氨基酸，并且在改变淀粉结构方面效果相对有限，同时研究发现tasbeiia纯合stopgain突变的小麦系(rs140、rs100和rs2)的淀粉分子结构变化更为显著。李晶莹等(2021)通过crispr-cas9基因编辑技术产生了tabeiia单突变体、二突变体以及三突变体材料，通过对成熟籽粒电镜扫描发现随着突变同源基因型数目的增加淀粉颗粒出现不同程度的变形，呈现剂量效应，其中三突变基因型淀粉颗粒形态变化最为明显。

4、前人对于创制高直链淀粉含量小麦的遗传策略进行了大量研究，但对于直链淀粉含量小麦分子标记的开发及应用研究相对较少。本发明拟开发与小麦直链淀粉含量显著关联的分子标记，从而有利于筛选出含有突变基因型且能稳定遗传的高直链淀粉小麦材料，缩短育种进程，以期为小麦高直链淀粉选育工作提供技术支持。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供与小麦直链淀粉含量显著关联的分子标记kasp-sbeiia-d及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。该分子标记与小麦直链淀粉含量具有较高的相关性，可应用于高直链淀粉小麦的分子标记辅助选择育种。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种与小麦直链淀粉含量显著关联的分子标记kasp-sbeiia-d，所述分子标记kasp-sbeiia-d的核苷酸序列如seq id no.1所示，在所述核苷酸序列的第22位处碱基存在一个snp位点，为g/a突变。

4、本发明还提供一种鉴别小麦直链淀粉含量性状的kasp引物组合，包括两条正向引物和一条通用反向引物；所述两条正向引物的核苷酸序列分别如seq id no.2和seq idno.3所示，所述通用反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

5、本发明还提供上述的kasp引物组合在制备鉴别小麦直链淀粉含量性状的产品中的应用。

6、进一步地，所述产品为试剂盒。

7、本发明还提供一种鉴别小麦直链淀粉含量性状的产品，包括上述的kasp引物组合。

8、进一步地，所述产品为试剂盒。

9、本发明还提供上述的分子标记kasp-sbeiia-d、kasp引物组合或产品在鉴别小麦直链淀粉含量性状中的应用。

10、本发明还提供一种鉴别小麦直链淀粉含量性状的方法，包括以下步骤：

11、提取得到待检小麦的dna；

12、以所述dna为模板，利用上述的kasp引物组合进行荧光定量pcr扩增，得到待检小麦的基因型，根据所述基因型判断所述待检小麦的直链淀粉含量：aa和ga基因型小麦的直链淀粉含量高于gg基因型小麦。

13、进一步地，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：higeno 2×probe mix b 3μl、kasp引物混合液0.0825μl、模板dna 3μl和ddh2o 4μl。

14、进一步地，所述荧光定量pcr扩增的反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性30s，61℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.8℃；94℃变性30s，53℃退火延伸60s，循环34次。

15、本发明公开了以下技术效果：

16、本发明以高直链淀粉小麦材料ham-2及ham-2×中麦255创建的f2代群体为材料，通过重测序在淀粉合成相关基因上筛选到大量的snp位点，发现在淀粉分支酶基因tasbeiia的d亚基因组上含有1个stopgain突变位点。针对筛选到的控制淀粉分支酶基因tasbeiia的stopgain突变位点，开发了一个分子标记——kasp-sbeiia-d，并在f2群体中进行验证。通过基因分型，并结合f2群体直链淀粉含量测定结果，探究不同基因型对直连淀粉含量的影响。该分型结果说明了该分子标记的可靠性以及与小麦直链淀粉含量具有较高的相关性，因此可将该分子标记应用于高直链淀粉小麦的分子标记辅助选择育种。

17、本发明提供的分子标记可以筛选出含有突变基因型且能稳定遗传的高直链淀粉小麦材料，从而缩短育种进程，为小麦高直链淀粉选育工作提供了技术支持。

技术特征：

1.一种与小麦直链淀粉含量显著关联的分子标记kasp-sbeiia-d，其特征在于，所述分子标记kasp-sbeiia-d的核苷酸序列如seq id no.1所示，在所述核苷酸序列的第22位处碱基存在一个snp位点，为g/a突变。

2.一种鉴别小麦直链淀粉含量性状的kasp引物组合，其特征在于，包括两条正向引物和一条通用反向引物；所述两条正向引物的核苷酸序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示，所述通用反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

3.一种如权利要求2所述的kasp引物组合在制备鉴别小麦直链淀粉含量性状的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。

5.一种鉴别小麦直链淀粉含量性状的产品，其特征在于，包括权利要求2所述的kasp引物组合。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。

7.一种如权利要求1所述的分子标记kasp-sbeiia-d、权利要求2所述的kasp引物组合或权利要求5或6所述的产品在鉴别小麦直链淀粉含量性状中的应用。

8.一种鉴别小麦直链淀粉含量性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的反应体系为：higeno 2×probe mix b 3μl、kasp引物混合液0.0825μl、模板dna 3μl和ddh2o 4μl。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性30s，61℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.8℃；94℃变性30s，53℃退火延伸60s，循环34次。

技术总结本发明公开了与小麦直链淀粉含量显著关联的分子标记KASP‑SBEIIa‑D及其应用，涉及小麦育种技术领域。该分子标记KASP‑SBEIIa‑D的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在所述核苷酸序列的第22位处碱基存在一个SNP位点，为G/A突变。本发明针对筛选到的TaSBEIIa基因的Stopgain突变位点，开发了一个分子标记，并在F<subgt;2</subgt;群体中进行验证。通过基因分型，并结合F<subgt;2</subgt;群体直链淀粉含量测定结果，探究不同基因型对直连淀粉含量的影响，该分型结果说明了该分子标记的可靠性以及与小麦直链淀粉含量具有较高的相关性，因此可将该分子标记应用于高直链淀粉小麦的分子标记辅助选择育种。技术研发人员：邓志英,吕倩倩,迟松岐,张禹峰,田纪春,彭莉受保护的技术使用者：山东农业大学技术研发日：技术公布日：2024/11/4