一种检测耳聋基因突变的试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学，涉及一种基因突变的检测试剂盒，具体涉及一种检测耳聋基因突变的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、耳聋病是临床上最常见的遗传性疾病之一，也是影响人类健康的常见疾病。患儿由于未能及时检出，错过了最佳治疗时间。在大量迟发性听力下降患者中，许多患者因自身基因缺陷而致病或因基因缺陷和多态性造成对环境因素的易感性增加而致病。

2、gjb2、slc26a4、mtdna是导致中国大部分遗传性耳聋发生的3个最常见的致病基因，21％的聋人带有gjb2突变，15％的聋人带有slc26a4突变，44％的聋人带有mtdna突变，对以上几个基因进行检测可为绝大部分耳聋患者明确遗传学病因，此外，gjb2突变、slc26a4突变和mtdna突变在正常人群的携带率分别为3％、2～3％和1/300。gjb2基因在人类的耳蜗毛细胞中高表达，若其编码区域发生突变，产生没有生物活性的蛋白质，会影响缝隙连接蛋白所组成通道的正常功能阻碍细胞间信息传递，影响细胞外钾离子回流，使corti氏器呈高钾状态，进而影响耳蜗毛细胞的电生理活动，导致听力下降。slc26a4基因编码离子转运相关蛋白，该基因突变可导致常染色体隐性耳聋dfnb4和pendred综合征(可表现为前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)，是仅次于gjb2突变引起的常染色体隐性遗传耳聋的病因。gjb3基因突变引起的耳聋主要是以常染色体显性遗传方式，其特点是，只要父母双方有一方是该基因突变的携带者，则子女成为耳聋患者的几率较高。线粒体基因mtdna 12s rrna突变导致的耳聋主要与氨基糖苷类药物使用有关。突变携带者对氨基糖苷类药物异常敏感，低剂量使用就会出现耳鸣，甚至严重的听力下降，该突变遵循母系遗传方式。

3、目前，常用的技术是采用荧光pcr(fluorescence quantitative pcr,fq-pcr)技术。现有技术cn 108823302 a涉及一种耳聋基因检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括对耳聋基因突变检测特异性引物对和耳聋基因特异性分子信标探针；其中，所述耳聋基因的突变检测的位点为ivs7-2、gjb2、12srrna-1494和12s rrna-1555突变位点。该发明对耳聋基因突变具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，能够辅助临床治疗，具有重要价值。但其未曾覆盖大部分的耳聋发生的常见的致病基因，只涉及到少数的四个突变位点。

4、现有技术cn 104711366 a明公开了一种药物性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒，针对药物耳聋相关基因mtdna12s rrna：1555a>g、1494c>t、1095t>c、827a>g上共四个位点设计2对特异性引物和4条taqman探针，以管家基因b-actin作为内参，设计1对特异性引物和探针，以监测样本模板、反应体系的有效性，避免出现假阴性，同时阴性、阳性质控的设定保证检测结果准确性。该发明首次实现了应用多通道荧光pcr方法在同一个反应管中同时检测药物性耳聋的四个突变位点，该方法操作简便快速、准确、高通量、成本低，闭管操作避免交叉污染，使得耳聋筛查目的性强、筛查范围广，有效预防药物性耳聋发生，易于推广及应用。但其同样未曾覆盖大部分的耳聋发生的常见的致病基因，只涉及到少数的四个突变位点，且存在一个管内的相互干扰。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种一次性同时检测多个耳聋基因突变位点的耳聋基因检测试剂盒，且避免了荧光串扰而导致特异性降低。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一种检测耳聋基因的试剂盒，包括检测多个耳聋基因突变位点的检测体系，所述多个耳聋基因突变位点选自gjb2 109、gjb2 ivs1+1、gjb2 176-191del16、gjb2 235、gjb2299、gjb3 538、slc26a4 1226、slc26a4 1229、slc26a4 ivs7-2、slc26a4 2168、12s rrna1494、12s rrna 1555任意组合；

4、所述检测体系中分为若干混合体系，

5、在任意其中一个混合体系中，检测gjb2 235位点的引物-探针组合和，检测slc26a4 1226位点的引物-探针组合或检测slc26a4 1229位点的引物-探针组合中的任意一个或两个，不同时存在一个体系中；

6、在任意其中一个混合体系中，检测slc26a4 ivs7-2位点的引物-探针组合和，检测gjb3 538位点的引物-探针组合或检测gjb2 109位点的引物-探针组合中的任意一个或两个，不同时存在一个体系中；

7、在任意其中一个混合体系中，不同时存在检测12s rrna 1494位点的引物-探针组合和检测gjb2 176-191del16位点的引物-探针组合。

8、一管内如果同时检测的位点过多，例如本发明中的12个位点，就避免不了两个位点使用同一种荧光通道，如此就可能产生相互干扰，实验结果会出现非特异性熔曲峰。而本发明经过大量的试验验证后发现，上述12个位点中，235位点和1226位点、1229位点两个位点中的任意一个或两个在同一个体系的情况下，扩增时会产生引物二聚体；ivs7-2位点和538位点、109位点两个位点中的任意一个或两个在同一个体系的情况下，扩增时会产生引物二聚体；1494位点和176-191del16位点在同一个体系的情况下，扩增时会产生引物二聚体。因此，在检测的时候，需要将上述产生干扰的基因分成不同的检测体系，以避免干扰。

9、在其中一个优选的实施例中，所述多个耳聋基因突变位点为gjb2 109、gjb2ivs1+1、gjb2 176-191del16、gjb2 235、gjb2 299、gjb3 538、slc26a4 1226、slc26a41229、slc26a4 ivs7-2、slc26a4 2168、12s rrna 1494和12s rrna 1555的组合。

10、在其中一个优选的实施例中，所述检测体系中分为3-6个混合体系。

11、在其中一个优选的实施例中，所述检测体系中包括耳聋基因检测体系1、耳聋基因检测体系2和耳聋基因检测体系3；

12、其中，耳聋基因检测体系1包括：检测gjb2 109位点的引物-探针组合a、检测gjb2ivs1+1位点的引物-探针组合b、检测gjb2 176-191del16位点的引物-探针组合c、检测gjb2235位点的引物-探针组合d；

13、其中耳聋基因检测体系2包括：检测gjb2 299位点的引物-探针组合e、检测gjb3538位点的引物-探针组合f、检测slc26a4 1226位点的引物-探针组合g、检测slc26a41229位点的引物-探针组合h；

14、其中耳聋基因检测体系3包括：检测slc26a4 ivs7-2位点的引物-探针组合i、检测slc26a4 2168位点的引物-探针组合j、检测线粒体12s rrna 1494位点的引物-探针组合k、检测线粒体12s rrna 1555位点的引物-探针组合l。

15、经过排除以上组合再将每4个位点组合成一个体系，上述分组是最优的。所述分组避免了多个位点的引物探针混在一管而造成荧光串扰和产生引物二聚体或其他非特异性扩增。

16、在其中一个优选的实施例中，所述检测gjb2 109位点的引物-探针组合a包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:1所示，下游引物的序列如seq idno:2所示，探针的序列如seq id no:3所示。

17、在其中一个优选的实施例中，所述检测gjb2 ivs1+1位点的引物-探针组合b包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:4所示，下游引物的序列如seqid no:5所示，探针的序列如seq id no:6所示。

18、在其中一个优选的实施例中，所述检测gjb2 176-191del16位点的引物-探针组合c包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:7所示，下游引物的序列如seq id no:8所示，探针的序列如seq id no:9所示。

19、在其中一个优选的实施例中，所述检测gjb2 235位点的引物-探针组合d包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:10所示，下游引物的序列如seq idno:11所示，探针的序列如seq id no:12所示。

20、在其中一个优选的实施例中，所述检测gjb2 299位点的引物-探针组合e包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:13所示，下游引物的序列如seq idno:14所示，探针的序列如seq id no:15所示。

21、在其中一个优选的实施例中，所述检测gjb3 538位点的引物-探针组合f包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:16所示，下游引物的序列如seq idno:17所示，探针的序列如seq id no:18所示。

22、在其中一个优选的实施例中，所述检测slc26a4 1226位点的引物-探针组合g包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:19所示，下游引物的序列如seq id no:20所示，探针的序列如seq id no:21所示。

23、在其中一个优选的实施例中，所述检测slc26a4 1229位点的引物-探针组合h包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:22所示，下游引物的序列如seq id no:23所示，探针的序列如seq id no:24所示。

24、在其中一个优选的实施例中，所述检测slc26a4 ivs7-2位点的引物-探针组合i包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:25所示，下游引物的序列如seq id no:26所示，探针的序列如seq id no:27所示。

25、在其中一个优选的实施例中，所述检测slc26a4 2168位点的引物-探针组合j包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:28所示，下游引物的序列如seq id no:29所示，探针的序列如seq id no:30所示。

26、在其中一个优选的实施例中，所述检测线粒体12s rrna 1494位点的引物-探针组合k包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:31所示，下游引物的序列如seq id no:32所示，探针的序列如seq id no:33所示。

27、在其中一个优选的实施例中，所述检测线粒体12s rrna 1555位点的引物-探针组合l包括：上游引物、下游引物和探针；上游引物的序列如seq id no:34所示，下游引物的序列如seq id no:35所示，探针的序列如seq id no:36所示。

28、在其中一个优选的实施例中，所述检测耳聋基因的试剂盒中，每份检测份量中，每条上游引物的加入量为0.2μl，每条下游引物的加入量为0.4-2.0μl；每条探针的加入量为0.6μl。

29、在其中一个优选的实施例中，所述检测耳聋基因的试剂盒，每份检测份量中，还包括10μl pcr buffer、5μl dntps和0.2μl pcr反应酶。

30、在其中一个优选的实施例中，任意其中一个混合体系中的不同探针分别用不同的荧光基团标记。

31、在其中一个优选的实施例中，耳聋基因检测体系1、耳聋基因检测体系2或耳聋基因检测体系3中的四个探针分别用不同的荧光基团标记。

32、在其中一个优选的实施例中，耳聋基因检测体系1、耳聋基因检测体系2或耳聋基因检测体系3中的四个探针分别用fam、hex、tet、joe、ned、vic、cy3、cy5、rox或tamra中的任意一种荧光基团标记。

33、本发明中，当分子信标处于自由状态时，发夹结构的两个末端靠近使f与q靠近，f被淬灭；当有靶序列存在时，分子信标与靶序列结合，使分子信标的茎杆区被拉开，此时r荧光不能被淬灭，可检测到荧光信号。

34、在其中一个优选的实施例中，所述检测耳聋基因的试剂盒中还包括野生型对照和阴性对照。

35、在其中一个优选的实施例中，所述野生型对照为人基因组质粒；所述阴性对照为无酶水。

36、第二方面，本发明提供一种利用如上述的试剂盒用于制备检测耳聋基因突变的试剂中的应用，包括以下步骤：

37、(1)提取样本dna；

38、(2)分成若干组，向步骤(1)样本dna中加入pcr缓冲液、taq酶、dntps、mgcl2、耳聋基因突变检测特异性引物对、耳聋基因的特异性探针、野生型对照和阴性对照；

39、(3)pcr扩增。

40、在其中一个优选的实施例中，pcr扩增的程序如下：

41、95℃5min；95℃15s，58℃45s，50个循环；58℃退火，采集荧光信号总量；

42、95℃2min，40℃5min，35℃～90℃，20min，其中40℃～80℃以0.04℃/s的速率升温，且在此阶段采集剩余的荧光信号。

43、本发明的基本原理是利用不对称pcr及熔解曲线分析技术进行基因检测。按照所选择的条件将所有引物、探针、酶和dna模板加入同一pcr扩增反应管，进行多重不对称pcr扩增，随后进行低温到高温的熔解曲线分析，由于荧光探针与匹配程度不同靶形成的异源双链的稳定性不同，即tm值不同，荧光探针与完全互补的靶形成的异源双链的熔点最高，与有一个或两个碱基错配的靶形成的异源双链的熔点较低，其熔点与错配碱基的类型、位置均有关系，故一种特定的基因型对应一个特异的tm值，通过不同tm值即可获知不同基因型(tm值为仪器根据双链dna结合程度进行计算)。

44、本发明采用不对称熔解曲线技术，单链荧光探针通过与扩增产物特异杂交，形成新的双链dna。不同基因型的扩增产物与荧光探针形成的双链dna在从低温到高温的熔解过程中，会出现不同的熔解特征，可据此区分纯合野生型、杂合突变型和纯合突变型。利用实验室较为常见的荧光pcr仪器，选择普通价廉的taqman探针，根据dna 解链温度的差异及不同的荧光信号，判定检测结果及分型。既保留了taqman探针法闭管检测无污染的特点，又实现了一管试剂同时对多个位点的检测。具有通量大、操作简单、成本低、精度可靠等优点。

45、本发明具有如下有益效果：(1)单管检测位点多：本发明充分挖掘了多重不对称pcr和探针熔解曲线技术的潜力，采用优化的四重pcr扩增体系和探针杂交体系、在每个体系同时进行4个位点的检测，从而实现了同时检测12个位点，在单管检测位点数目上实现了突破，避免了临床上针对同一样本进行多管检测的不便，也避免了太多位点的引物探针杂糅一管出现二聚体和荧光串扰而导致特异性降低。(2)突变覆盖率高：本发明针对中国人群最常见4个耳聋易感基因12个位点进行检测，对中国人群的突变覆盖率高。(3)通量高、成本低：本发明在3管pcr体系中完成4个基因12个位点的突变检测，大幅节约反应物料，而且pcr扩增可以在普通pcr仪上运行，降低成本。(4)简便快速、耗时短：本发明基于荧光pcr熔解曲线分析技术，pcr扩增结束后经一次荧光pcr熔解曲线分析即可获知样本基因型，整个操作可在2～3小时完成。(5)减少污染：本发明为均相检测体系，pcr及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需pcr后处理，减少了pcr产物的污染。(6)检测特异性高、结果容易判读：本发明是通过熔解峰对应的熔点来判定基因型，结果易于判读，准确可靠，故检测特异性高。