一种PTOV1蛋白单克隆抗体的制备及应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种ptov1蛋白单克隆抗体的制备及应用。

背景技术：

1、结直肠癌(crc)是全球范围内常见的恶性肿瘤，是在全球范围内造成患者死亡的主要原因之一。根据2020年全球数据统计，crc已成为全球第三大常见肿瘤，并为癌相关死亡的第二大原因。尽管诊断方法和治疗手段不断精进，crc仍在2020年造成全球约93万人死亡。鉴于早期crc临床症状不明显，因此寻找新的敏感的crc诊断生物标志物有助于早期诊断和评估疾病预后。

2、前列腺肿瘤过表达1(ptov1)是2001年在前列腺癌组织过表达基因差异筛查项目中首次发现的新基因。其在正常前列腺组织中基本未检出或表达量极低，而在前列腺癌组织中高度表达。在前列腺癌中，ptov1表达水平与细胞增殖指数呈正相关，是影响前列腺癌进展的关键因素。同时，在侵袭性较强的肿瘤中，ptov1的表达水平与肿瘤分级及预后相关，提示该蛋白可能是肿瘤侵袭性疾病的一种新的标志物。

3、我们的研究结果显示，ptov1在人类结直肠癌组织中高度表达，特别是在晚期，并且与结直肠癌患者的生存时间缩短有关。功能研究表明，ptov1促结直肠癌的肿瘤生长和转移。这项工作揭示了ptov1在促进结直肠癌进展中的功能作用和机制，可能为结直肠癌治疗提供新的靶点。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种ptov1蛋白单克隆抗体的制备及应用，为结直肠癌治疗提供新的靶点。

2、本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种ptov1蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

3、s1，扩增ptov1基因的全长外显子序列，使用连接酶将扩增后的ptov1基因插入载体获得重组质粒，然后将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，获得阳性菌；

4、s2，将步骤s1的阳性菌接入培养基中振荡培养，经过诱导表达后提取上清液，纯化后获得纯化的ptov1抗原；

5、s3，将步骤s2纯化的ptov1抗原免疫动物，制备脾细胞悬液，提取rna并反转录获得cdna，然后pcr扩增抗体重链和轻链可变区序列；

6、s4，将步骤s3的pcr产物插入噬菌体展示载体，转化大肠杆菌感受态细胞获得重组质粒；

7、s5，加入辅助噬菌体感染步骤s4的重组质粒，然后加入步骤s2纯化的ptov1抗原蛋白进行亲和性筛选，得到亲和力高的阳性噬菌体；

8、s6，将筛选的阳性噬菌体序列插入酶切的质粒，鉴定测序后转染至293t细胞生产ptov1蛋白单克隆抗体。

9、本发明还提供了一种ptov1蛋白单克隆抗体，由上述的方法制备得到。

10、在以上技术方案的基础上，优选的，所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.3-5所示，重链互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.8-10所示。

11、在以上技术方案的基础上，优选的，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示。

12、在以上技术方案的基础上，优选的，所述轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述重链的氨基酸序列如seq id no.6所示。

13、本发明还提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码上述的单克隆抗体。

14、本发明还提供了一种重组dna表达载体，所述重组dna表达载体包括上述的多核苷酸分子。

15、本发明还提供了一种ptov1蛋白单克隆抗体在制备结直肠癌药物中的应用。

16、本发明的一种ptov1蛋白单克隆抗体的制备及应用相对于现有技术具有以下有益效果：本发明基于噬菌体展示技术，能够快速、准确制备单一的ptov1蛋白单克隆抗体，有利于其作为相关癌症生物标志物或提供科学研究之需要，为结直肠癌治疗提供新的靶点。

技术特征：

1.一种ptov1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.一种ptov1蛋白单克隆抗体，其特征在于：由权利要求1所述的方法制备得到。

3.如权利要求2所述的一种ptov1蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体包括轻链和重链，所述轻链互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.3-5所示，重链互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.8-10所示。

4.如权利要求3所述的一种ptov1蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示。

5.如权利要求4所述的一种ptov1蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述重链的氨基酸序列如seq id no.6所示。

6.一种多核苷酸分子，其特征在于：所述多核苷酸分子编码权利要求2-5任一项所述的单克隆抗体。

7.一种重组dna表达载体，其特征在于：所述重组dna表达载体包括权利要求6所述的多核苷酸分子。

8.如权利要求2-5任一项所述的一种ptov1蛋白单克隆抗体在制备结直肠癌药物中的应用。

技术总结本发明涉及生物医药技术领域，提出了一种PTOV1蛋白单克隆抗体的制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：S1，扩增PTOV1基因的全长外显子序列，使用连接酶将扩增后的PTOV1基因插入载体获得重组质粒，然后将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，获得阳性菌；S2，将阳性菌接入培养基中振荡培养，经过诱导表达后提取上清液，纯化后获得纯化的PTOV1抗原；S3，将纯化的PTOV1抗原免疫动物，制备脾细胞悬液，提取RNA并反转录获得cDNA，然后PCR扩增抗体重链和轻链可变区序列；S4，将PCR产物插入噬菌体展示载体，转化大肠杆菌感受态细胞获得重组质粒；S5，加入辅助噬菌体感染重组质粒，然后加入纯化的PTOV1抗原蛋白进行亲和性筛选，得到亲和力高的阳性噬菌体；S6，将筛选的阳性噬菌体序列插入酶切的质粒，鉴定测序后转染至293T细胞生产PTOV1蛋白单克隆抗体。本发明基于噬菌体展示技术，能够快速、准确制备单一的PTOV1蛋白单克隆抗体，有利于其作为相关癌症生物标志物或提供科学研究之需要，为结直肠癌治疗提供新的靶点。技术研发人员：项诗棋受保护的技术使用者：武汉科技大学技术研发日：技术公布日：2024/11/4