与肿瘤细胞5-氟尿嘧啶耐药性相关的hsa-miR-10523及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及与肿瘤细胞5-氟尿嘧啶（简称5-fu）耐药性相关的分子标志物及其应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤，也被称作癌症，是全球范围内对人类健康构成重大威胁的疾病。据世界卫生组织统计，每年全球约有1270万新发癌症病例，约760万人因癌症去世。预计到2030年，每年因癌症死亡的人数将超过1310万。目前，癌症的传统治疗手段主要包括外科手术、化疗和放疗。化疗，也称为药物治疗，通过使用药物来杀死癌细胞或阻止其生长。然而，化疗药物的剂量依赖性毒性限制了其治疗效果，并且随着时间的推移，肿瘤可能对这些药物产生耐药性，这进一步降低了治疗效果。

2、5-氟尿嘧啶（5-fu）是一种常用的化疗药物，它通过干扰癌细胞的dna合成和修复，从而抑制癌细胞的生长。然而，5-氟尿嘧啶的使用也面临着耐药性问题，这限制了其在癌症治疗中的长期效果。为了克服肿瘤耐药性，提高化疗和靶向治疗的疗效，降低耐药风险，并延长患者的生存期，本领域迫切地需要深入探索，希望能够提高5-氟尿嘧啶在癌症治疗中的疗效，降低耐药性的风险，并最终延长患者的生存期和改善生活质量。

技术实现思路

1、本发明的目的在于寻找提高肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶药物敏感性的关键microrna并开发相应的检测试剂及治疗药物。

2、为实现上述目的，本发明通过对bel-7402肝细胞癌细胞的培养及bel-7402/fu耐药细胞株的建立，采用荧光定量pcr检测bel-7402野生细胞和耐药细胞bel-7402/fu中基因差异表达，发现hsa- mir- 10523在对5-氟尿嘧啶耐药的人肝细胞癌细胞株中呈显著高表达，实验表明hsa- mir- 10523可以作为肝细胞癌对5-fu耐药性的标志物。

3、进一步研究hsa- mir - 10523在肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶耐药中的作用，将hsa-mir - 10523 抑制剂转染bel-7402/fu胞后与对照组进行对比，发现5-氟尿嘧啶对转染hsa- mir - 10523 抑制剂后bel-7402/fu细胞的ic50值较对照组显著降低。实验表明抑制hsa- mir – 10523表达能够增加bel-7402/fu细胞对5-氟尿嘧啶的敏感度。

4、进一步用细胞平板克隆形成实验检测转染后bel-7402/fu耐药细胞的增殖能力，研究发现抑制hsa- mir - 10523可以明显抑制bel-7402/fu细胞增殖及克隆形成。

5、基于上述研究，本发明为寻找新的分子治疗靶标，指导临床用药，并更加有效对抗5-氟尿嘧啶耐药提供科学的依据。

6、为实现发明目的，本发明提供的具体技术方案如下：

7、本发明提供了一种人肝细胞癌对5-氟尿嘧啶耐药性的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为hsa-mir-10523，其核苷酸序列如seq id no：1所示，hsa-mir-10523在对5-氟尿嘧啶耐药的肝细胞癌细胞中表达量升高。

8、所 述 hsa- mir - 10523 的 核 苷 酸 序 列 为如seq id no.1 所 示 ，gacaatgatgagaagacctgagga。

9、本发明提供一种检测人肝细胞癌对5-氟尿嘧啶耐药性的检测试剂，用于检测核苷酸序列如seq id no：1所示标志物hsa-mir-10523的表达水平，所述检测试剂包含逆转录试剂和扩增试剂，逆转录试剂中含有hsa-mir-10523反转录引物，反转录引物的核苷酸序列如seq id no：2所示；扩增试剂中含有hsa-mir-10523扩增引物对，hsa-mir-10523正向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示，hsa-mir-10523反向引物的核苷酸序列如seq id no：4所示。

10、所述的检测试剂，还包括10 ×buffer、dntp、mgcl2、taq酶和taqman探针。

11、本发明提供了一种用于降低肝细胞癌细胞中hsa-mir-10523表达量的hsa-mir-10523 抑制剂。

12、所述hsa-mir-10523 抑制剂的核苷酸序列如seq id no：6所示，所述hsa-mir-10523 抑制剂选自以下能降低肝细胞癌细胞中hsa-mir-10523表达量的sirna、dsrna、shrna、mirna、反义核苷酸；或者能表达或形成所述sirna、 dsrna、shrna、mirna、反义核苷酸的构建物或者小分子化合物。

13、进一步，本发明提供了 hsa-mir-10523 抑制剂在制备逆转肝细胞癌对5-氟尿嘧啶耐药性药物中的应用。

14、药物中含有的hsa-mir-10523 抑制剂下调肝细胞癌耐药细胞中hsa-mir-10523的表达，能逆转肝细胞癌耐药细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性。

15、进一步，本发明提供了hsa-mir-10523 抑制剂在制备肝细胞癌对5-氟尿嘧啶药物敏感性的促进剂中的应用。

16、所述促进剂中含有的hsa-mir-10523 抑制剂下调肝癌耐药细胞中hsa-mir-10523的表达，提高肝细胞癌耐药细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。

17、进一步，本发明提供了hsa-mir-10523 抑制剂与5-氟尿嘧啶在制备肝癌化疗药物中的应用。

18、药物中含有的hsa-mir-10523 抑制剂下调肝细胞癌耐药细胞中hsa-mir-10523的表达，抑制肝细胞癌耐药细胞的增殖速度和克隆形成能力。

19、进一步，本发明提供了一种肝癌化疗药物，其特征为，所述药物以hsa-mir-10523抑制剂和5-氟尿嘧啶为主要活性成分，所述hsa-mir-10523 抑制剂的核苷酸序列如seq idno：6所示，hsa-mir-10523 抑制剂下调肝细胞癌耐药细胞中hsa-mir-10523的表达，抑制肝细胞癌耐药细胞的增殖速度和克隆形成能力。

20、基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

21、本发明通过bel-7402/fu细胞株发现hsa-mir-10523可以作为肝细胞癌对5-氟尿嘧啶耐药性的标志物；为肝细胞癌治疗提供了新的分子治疗靶标，hsa-mir-10523表达量能够反映患者对5-氟尿嘧啶的治疗的效果，有利于指导临床用药。

22、进一步研究发现：通过下调hsa-mir-10523能逆转bel-7402/fu细胞对5-氟尿嘧啶耐药；并且能抑制肝细胞癌bel-7402/fu细胞的增殖速度，同时也抑制其克隆形成能力。通过该microrna的抑制剂能够增加5-氟尿嘧啶的治疗效果，更具有临床转化价值，为有效对抗5-氟尿嘧啶耐药提供科学的依据。

技术特征：

1.一种人肝细胞癌对5-氟尿嘧啶耐药性的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为hsa-mir-10523，其核苷酸序列如seq id no：1所示，hsa-mir-10523在对5-氟尿嘧啶耐药的肝细胞癌细胞中表达量升高。

2.一种检测人肝细胞癌对5-氟尿嘧啶耐药性的检测试剂，其特征在于，用于检测核苷酸序列如seq id no：1所示的标志物hsa-mir-10523的表达水平，所述检测试剂包含逆转录试剂和扩增试剂，逆转录试剂中含有hsa-mir-10523反转录引物，反转录引物的核苷酸序列如seq id no：2所示；扩增试剂中含有hsa-mir-10523扩增引物对，hsa-mir-10523正向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示，hsa-mir-10523反向引物的核苷酸序列如seq id no：4所示。

3. 用于降低肝细胞癌细胞中hsa-mir-10523表达量的hsa-mir-10523 抑制剂，其特征在于，所述hsa-mir-10523 抑制剂的核苷酸序列如seq id no：6所示，所述hsa-mir-10523抑制剂选自以下能降低肝细胞癌细胞中hsa-mir-10523表达量的sirna、dsrna、shrna、mirna、反义核苷酸；或者能表达或形成所述sirna、 dsrna、shrna、mirna、反义核苷酸的构建物或者小分子化合物。

4.hsa-mir-10523 抑制剂在制备逆转肝细胞癌对5-氟尿嘧啶耐药性药物中的应用，药物中含有的 hsa-mir-10523 抑制剂下调肝细胞癌耐药细胞中hsa-mir-10523的表达，能逆转肝细胞癌耐药细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性。

5. hsa-mir-10523 抑制剂在制备肝细胞癌对5-氟尿嘧啶药物敏感性的促进剂中的应用，促进剂中含有的 hsa-mir-10523 抑制剂下调肝细胞癌耐药细胞中hsa-mir-10523的表达，提高肝细胞癌耐药细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。

6. hsa-mir-10523 抑制剂与5-氟尿嘧啶在制备肝癌化疗药物中的应用，药物中含有的hsa-mir-10523 抑制剂下调肝细胞癌耐药细胞中hsa-mir-10523的表达，抑制肝细胞癌耐药细胞的增殖速度和克隆形成能力。

7.一种肝癌化疗药物，其特征为，所述药物以hsa-mir-10523 抑制剂和5-氟尿嘧啶为主要活性成分，所述hsa-mir-10523 抑制剂的核苷酸序列如seq id no：6所示，hsa-mir-10523 抑制剂下调肝细胞癌耐药细胞中hsa-mir-10523的表达，抑制肝细胞癌耐药细胞的增殖速度和克隆形成能力。

技术总结本发明公开了与肿瘤细胞5‑氟尿嘧啶耐药性相关的hsa‑miR‑10523及其应用；本发明通过建立Bel‑7402/Fu耐药细胞株及其检测实验，发现hsa‑miR‑10523在肝细胞癌耐药细胞中显著过表达，可作为肝细胞癌对5‑FU耐药性的标志物。进一步研究发现：抑制hsa‑miR‑10523表达能逆转Bel‑7402/Fu细胞对5‑FU耐药性，提高药物敏感性；抑制hsa‑miR‑10523表达能抑制肝细胞癌耐药细胞的增殖速度及克隆形成能力。本发明提供了新的肝细胞癌分子治疗靶标，并为指导临床用药，有效对抗5‑FU耐药性提供科学的依据。技术研发人员：陈梦梦,张炳强,张冰,米哈伊尔·文尼阿米诺维奇·乌格柳莫夫,于俊梅,栾延松,马永超,孙国龙,邹伟,付学奇,孙允东受保护的技术使用者：青岛瑞思德生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4