一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法及其应用与流程

本发明涉及外泌体领域，尤其涉及一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法及其应用。

背景技术：

1、脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，其来源于中胚层具有高度自我更新和多向分化能力，因此具有广阔的临床应用前景。

2、外泌体是指直径在30-150nm之间包含rna、microrna、蛋白质、dna片段等的茶托型结构的小囊泡。人体几乎所有的细胞都可以分泌外泌体，其天然存在于体液中，包括唾液、尿液、脑脊液、血液和乳汁等。脐带间充质干细胞也不例外，在正常及病理状态下脐带间充质干细胞均可分泌外泌体。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。相比于脐带间充质干细胞，外泌体细胞因含有母细胞来源的蛋白质、脂质和核酸，并且因其分子量小、渗透性强等优点可作为信号分子作用于其它细胞。

3、如中国专利，申请号，cn202310651210.6的一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法，将人脐带间充质干细胞接种于可变溶氧条件的3d生物反应器中，溶氧条件为常氧转低氧培养，常氧条件氧分压控制为50％，低氧条件氧分压控制为15％。该发明的有益效果是：在3d生物反应器内常氧转低氧条件下培养的脐带间充质干细胞外泌体表达量较常氧、低氧及低氧转常氧条件明显提高；适于批量生产，易于推动脐带来源间充质干细胞外泌体生物产品的工业化生产。

4、但虽然低氧环境下细胞分泌体数量增加，但是对于细胞的生长速度大大降低，整体的外泌体含量有待提高。

技术实现思路

1、本申请实施例通过提供一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法及其应用，解决了现有技术中，细胞分泌外泌体数量不足的问题，实现了更多外泌体的提取及更高纯度的外泌体。

2、本申请实施例提供了一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，包括如下步骤：

3、s1、复苏冻存的p3代脐带间充质干细胞，于5％co2、37℃条件下采用dmem培养基进行细胞培养进行常氧培养48h，初始浓度为1×105个/cm2，并加入il-1β、tnf-α；其中il-1β浓度为10ng/ml，tnf-α浓度为10ng/ml；dmem培养基在45℃环境下保温24h；

4、s2、在常氧培养后进行高氧培养12-16h；

5、s3、在高氧培养后进行低氧培养48-72h；

6、s4、培养结束后，收获细胞培养上清液，经超速离心分离纯化得到人脐带间充质干细胞外泌体。

7、进一步的，所述常氧条件为20％o2浓度环境。

8、进一步的，所述超速离心法具体为：细胞培养上清液以300g离心10分钟，去除细胞和碎片，以2000g离心20分钟，去除细胞碎片和凋亡小体，以10000g离心30分钟，去除大囊泡，最后以100000g离心70分钟，收集外泌体沉淀，用pbs重悬为10ml的外泌体溶液。

9、进一步的，所述高氧培养的氧气浓度为40％-60％的o2浓度环境。

10、进一步的，所述低氧培养的氧气浓度为5％-10％的o2浓度环境。

11、进一步的，还将高氧培养步骤与低氧培养步骤顺序颠倒，即为：

12、s2、在常氧培养后进行低氧培养48-72h；

13、s3、在低氧培养后进行高氧培养12-16h。

14、进一步的，在氧气浓度变化的同时，co2同步变化。

15、进一步的，co2同步变化具体为：在常氧培养时，co2浓度为5％，在低氧培养时co2浓度为1-4％，在高氧培养时co2浓度为10-20％。

16、进一步的，细胞培养所用培养器皿内表面还涂覆细胞粘附抑制剂。

17、上述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的应用，应用于膝关节炎。

18、本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

19、其一、在高氧环境下，细胞会进行氧化应激，触发细胞内的信号转导通路，特别是与抗氧化反应和细胞存活相关的途径，促进细胞适应即将到来的低氧环境，调整代谢途径，从而优化能量利用，并提高外泌体的产生，并使细胞在初期进行大量的增殖，极大增加细胞数量；随后进入的低氧环境则诱导细胞进入保护性的代谢状态，减少不必要的能量消耗，同时再次促进外泌体的分泌，并逐渐降低细胞可能受到的损伤。

20、其二、先低氧再高氧，使细胞在低氧环境下先进入一种保护性的代谢状态，减少不必要的能量消耗，同时促进外泌体的分泌以应对缺氧环境，随后的高氧环境进一步刺激细胞，产生应激反应，导致外泌体的大量释放,细胞凋亡程序启动后会释放大量外泌体，但由于低氧培养环境，细胞应激后凋亡的速度变慢，使得凋亡小体产生后迅速被其他细胞吞噬，培养环境中的死细胞和细胞器官数量减少，外泌体纯度增加，并使细胞更好地适应缺氧和富氧环境的交替变化，提高细胞的抗逆性和生存能力，也是外泌体在应用于负载药物或体内载药时在缺氧或高氧环境下仍具有稳定性。

21、其三、外泌体的分泌受到细胞内外环境的多种因素影响，包括氧气和二氧化碳浓度，氧气浓度的变化可以影响细胞的代谢状态，进而影响外泌体的生成和分泌，低氧环境促进外泌体分泌的同时还增加细胞的抗氧化的能力，减少应激，而高氧环境则增加细胞应激，使其进入凋亡程序，增加外泌体的产出。

22、其四、通过涂覆细胞粘附抑制剂减少细胞在培养容器壁上的堆叠，从而改变细胞的生长环境和状态，即贴壁细胞减少，悬浮细胞增多，贴壁细胞减少则意味堆积的细胞减少，细胞对于氧气的利用更加均匀，避免培养过程中，局部堆积细胞的气体利用低于其他部分；悬浮细胞多则使细胞整体生长速度增加，使得细胞的总数和分泌能力都提高，进一步提高外泌体的产量。

技术特征：

1.一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，所述常氧条件为20％o2浓度环境。

3.如权利要求1所述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，所述超速离心法具体为：细胞培养上清液以300g离心10分钟，去除细胞和碎片，以2000g离心20分钟，去除细胞碎片和凋亡小体，以10000g离心30分钟，去除大囊泡，最后以100000g离心70分钟，收集外泌体沉淀，用pbs重悬为10ml的外泌体溶液。

4.如权利要求1所述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，所述高氧培养的氧气浓度为40％-60％的o2浓度环境。

5.如权利要求1所述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，所述低氧培养的氧气浓度为5％-10％的o2浓度环境。

6.如权利要求1所述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，还将高氧培养步骤与低氧培养步骤顺序颠倒，即为：

7.如权利要求6所述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，在氧气浓度变化的同时，co2同步变化。

8.如权利要求7所述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，co2同步变化具体为：在常氧培养时，co2浓度为5％，在低氧培养时co2浓度为1-4％，在高氧培养时co2浓度为10-20％。

9.如权利要求8所述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，细胞培养所用培养器皿内表面还涂覆细胞粘附抑制剂。

10.一种如权利要求1-9任意一项所述的一种培养脐带间充质干细胞外泌体的应用，其特征在于，应用于膝关节炎。

技术总结本申请公开了一种培养脐带间充质干细胞外泌体的方法及其应用，涉及外泌体技术领域，包括如下步骤：S1、复苏冻存的P3代脐带间充质干细胞，于5％CO2、37℃条件下采用DMEM培养基进行细胞培养进行常氧培养48h，并加入IL‑1β、TNF‑α；S2、在常氧培养后进行高氧培养12‑16h；S3、在高氧培养后进行低氧培养48‑72h；S4、培养结束后，收获细胞培养上清液，经超速离心分离纯化得到人脐带间充质干细胞外泌体；能够实现极大增加细胞数量；减少不必要的能量消耗，同时再次促进外泌体的分泌，并逐渐降低细胞可能受到的损伤。技术研发人员：赖金林,罗华英受保护的技术使用者：中乔健工生物科技（广东）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4