犬白介素-31受体αII的犬源化抗体的制作方法

本发明涉及犬il-31受体α的抗体，其对犬il-31受体α具有高结合亲和力，并且能够阻断犬il-31与犬il-31受体α的结合。本发明还涉及本发明的抗体在治疗狗的特应性皮炎中的用途。

背景技术：

1、免疫系统包括常驻和再循环特化细胞的网络，其协同作用以保护宿主抵抗感染性疾病和癌症。免疫系统执行这种功能的能力在很大程度上取决于由白细胞分泌的一组蛋白质的生物活性，这些蛋白质统称为白细胞介素。在充分研究的白介素中，有四种重要的分子被鉴定为白介素-31(il-31)、白介素-4(il-4)、白介素-13(il-13)和白介素-22(il-22)。尽管il4、il-13、il-22和il-31是产生针对细胞外病原体(例如，组织或腔居留寄生虫)的保护所需的免疫应答的关键细胞因子，但这些细胞因子也涉及人和动物中的过敏性疾病(包括特应性皮炎)的发病机理。

2、特应性皮炎(ad)是复发性瘙痒和慢性炎性皮肤病，其特征在于人的免疫系统失调和表皮屏障异常。特应性皮炎的病理学和免疫学属性已经成为广泛研究的主题[综述于rahman et al.inflammation&allergy-drug target 10:486-496(2011)和harskamp etal.,seminar in cutaneous medicine and surgery 32:132-139(2013)]。特应性皮炎也是伴侣动物(尤其是狗，其中估计其患病率为犬科动物群体的约10-15％)的常见病症。狗和猫的特应性皮炎的发病机理[综述于nuttall et al.,veterinary records 172(8):201-207(2013)]显示与人的特应性皮炎的显著相似性，包括多种免疫细胞的皮肤浸润和cd4+th2极化的包括il-31、il-4和il-13占优势的细胞因子环境。此外，il-22涉及过度上皮增殖，导致特应性皮炎特有的表皮增生。

3、例如，针对犬il-31的抗体已显示对犬的与特应性皮炎相关的瘙痒具有作用[us8，790，651b2；us10，093，731b2]。此外，已经测试了针对人il-31受体α(il-31ra)的抗体，并且发现其对人的与特应性皮炎相关的瘙痒具有作用[ruzicka,et al.,new england journalof medicine,376(9),826–835(2017)]。

4、已经证明有助于治疗特应性皮炎和/或已经显示出这样做的前景的药物包括：janus激酶(jak)抑制剂[参见例如u.s.8，133，899；u.s.8，987，283；wo 2018/108969]，脾酪氨酸激酶(syk)抑制剂[参见例如u.s.8，759，366]和th2细胞上表达的趋化性受体同源分子的拮抗剂[参见例如u.s.7，696，222、u.s.8，546，422、u.s.8，637，541和u.s.8，546，422]。

5、然而，尽管最近在治疗特应性皮炎方面取得了一些成功，但仍需要设计可解决犬特应性皮炎的一种或多种症状的替代性和/或更好的疗法。

6、本文中任何参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献可作为本技术的“现有技术”获得。

技术实现思路

1、本发明提供了针对来自犬的il-31受体α(il-31ra)的新的哺乳动物抗体，包括犬源化的鼠抗体。在某些实施方案中，针对犬il-31受体α(cil-31ra)的哺乳动物抗体是分离的抗体。在优选的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段结合犬il-31ra。在更具体的实施方案中，哺乳动物抗体或抗原结合片段还阻断犬il-31ra与犬白介素-31的结合。在某些实施方案中，哺乳动物抗体是针对犬il-31ra的抗体。在更具体的实施方案中，哺乳动物抗体是犬源化抗体。在甚至更具体的实施方案中，犬源化抗体是针对犬il-31ra的犬源化鼠抗体。

2、因此，本发明提供了结合犬白介素-31受体α并且包含重链的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，所述重链包含三个重链互补决定区(hcdr)的集合，cdr重链1(hcdr1)、cdr重链2(hcdr2)和cdr重链3(hcdr3)，其中所述hcdr1包含seq id no：3的氨基酸序列；所述hcdr2包含seq id no：10、seq id no：11、seq id no：12或seq id no：13的氨基酸序列；且所述hcdr3包含seq id no：20、seq id no：21、seq id no：22或seq id no：23的氨基酸序列。

3、在某些实施方案中，所述哺乳动物抗体或抗原结合片段还包含轻链，所述轻链包含三个轻链互补决定区(lcdr)的集合，cdr轻链1(lcdr1)、cdr轻链2(lcdr2)和cdr轻链3(lcdr3)，其中所述lcdr1包含seq id no：30或seq id no：31的氨基酸序列；所述lcdr2包含seq id no：38、seq id no：39或seq id no：40的氨基酸序列；且所述lcdr3包含seq id no：45的氨基酸序列。

4、在特定的实施方案中，当与犬il-31ra结合时，哺乳动物抗体或其抗原结合片段与seq id no：97、seq id no：103、seq id no：99或seq id no：102的氨基酸序列所包含的一个或多个表位结合。在更具体的实施方案中，当与犬il-31ra结合时，哺乳动物抗体或其抗原结合片段与两个表位结合，其中一个表位由seq id no：97的氨基酸序列包含，另一个表位由seq id no：103的氨基酸序列包含。在其它实施方案中，当与犬il-31ra结合时，哺乳动物抗体或其抗原结合片段与两个表位结合，其中一个表位由seq id no：99的氨基酸序列包含，另一个表位由seq id no：102的氨基酸序列包含。

5、在特定的实施方案中，当与犬il-31ra结合时，哺乳动物抗体或其抗原结合片段与seq id no：97的氨基酸序列所包含的表位结合。在其它实施方案中，当与犬il-31ra结合时，哺乳动物抗体或其抗原结合片段与seq id no：103的氨基酸序列所包含的表位结合。在其它实施方案中，当与犬il-31ra结合时，哺乳动物抗体或其抗原结合片段与seq id no：99的氨基酸序列所包含的表位结合。在其它实施方案中，当与犬il-31ra结合时，哺乳动物抗体或其抗原结合片段与seq id no：102的氨基酸序列所包含的表位结合。

6、在相关实施方案中，当与犬il-31ra结合时，抗体结合seq id no：97或seq id no：103，或seq id no：97和seq id no：103两者，和/或seq id no：99或seq id no：102，或seqid no：99和seq id no：102两者的氨基酸序列内的至少一个氨基酸残基，优选1至3个氨基酸残基，更优选2至5个氨基酸残基，和/或更优选3至8个氨基酸残基或更多。

7、在特定的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no：3的氨基酸序列的hcdr1，含有seq id no：10的氨基酸序列的hcdr2和含有seq id no：20的氨基酸序列的hcdr3。在这种类型的更具体的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有seq id no：30的氨基酸序列的lcdr1，含有seq id no：40的氨基酸序列的lcdr2和含有seq id no：45的氨基酸序列的lcdr3。

8、在其它实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no：3的氨基酸序列的hcdr1，含有seq id no：11的氨基酸序列的hcdr2和含有seq id no：21的氨基酸序列的hcdr3。在这种类型的更具体的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有seq id no：30的氨基酸序列的lcdr1，含有seq id no：40的氨基酸序列的lcdr2和含有seq id no：45的氨基酸序列的lcdr3。

9、在其它实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no：3的氨基酸序列的hcdr1，含有seq id no：12的氨基酸序列的hcdr2和含有seq id no：22的氨基酸序列的hcdr3。在这种类型的更具体的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有seq id no：30的氨基酸序列的lcdr1，含有seq id no：38的氨基酸序列的lcdr2和含有seq id no：45的氨基酸序列的lcdr3。

10、在其它实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段包含含有seq id no：3的氨基酸序列的hcdr1，含有seq id no：13的氨基酸序列的hcdr2和含有seq id no：23的氨基酸序列的hcdr3。在这种类型的更具体的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有seq id no：31的氨基酸序列的lcdr1，含有seq id no：39的氨基酸序列的lcdr2和含有seq id no：45的氨基酸序列的lcdr3。

11、在优选的实施方案中，抗体及其抗原结合片段结合犬il-31ra并阻断犬il-31ra与犬白介素-31的结合。在具体的实施方案中，针对犬il-31ra的哺乳动物抗体是鼠抗体。在特定实施方案中，针对犬il-31ra的哺乳动物抗体是犬源化抗体。在更具体的实施方案中，针对犬il-31ra的犬源化抗体是犬源化鼠抗体。

12、本发明的犬源化抗体包含犬片段可结晶区(cfc区)。本发明的犬源化抗体还包含犬轻链恒定区。在特定的实施方案中，犬轻链恒定区是κ犬轻链恒定区。在更具体的实施方案中，κ犬轻链恒定区包含seq id no：127的氨基酸序列。

13、此外，犬源化抗体或其抗原结合片段可包含含有cfc区和铰链区的重链。铰链区优选为犬铰链区。犬铰链区可包含天然存在的：igg-a铰链区，igg-b铰链区，igg-c铰链区，或igg-d铰链区。或者，铰链区是相应的修饰的犬铰链区。在特定的实施方案中，铰链区是包含含有与seq id no：112的氨基酸序列至少90％，95％或100％同一性的氨基酸序列的igg-a铰链区。在其它实施方案中，铰链区是包含含有与seq id no：113的氨基酸序列至少90％，95％或100％同一性的氨基酸序列的igg-b铰链区。在其它实施方案中，铰链区是包含含有与seq id no：114的氨基酸序列至少90％，95％或100％同一性的氨基酸序列的igg-c铰链区。在其它实施方案中，铰链区是包含seq id no：115的氨基酸序列的修饰的igg-d铰链区。

14、类似地，犬fc区可以是igg-a，igg-b，igg-c，igg-d或其修饰物。在特定的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含igg-bm。在某些实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含igg-a，所述igg-a包含含有与seq id no：116的氨基酸序列具有至少90％，95％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含igg-b，所述igg-b包含含有与seq id no：110的氨基酸序列具有至少90％，95％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有与seq id no：117的氨基酸序列具有至少90％，95％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列的igg-c。在其它实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有与seq id no：118的氨基酸序列具有至少90％，95％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列的igg-d。在其它实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含含有与seq id no：111的氨基酸序列具有至少90％，95％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列的igg-bm，其中seq id no：110的位置31处的天冬氨酸残基(d)和seq id no：110的位置63处的天冬酰胺残基(n)两者均保持被igg-bm序列中的丙氨酸残基(a)置换。

15、在特定的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段包含犬igg-d，但天然存在的igg-d铰链区被包含含有与seq id no：112的氨基酸序列至少90％，95％或100％同一性的氨基酸序列的铰链区取代。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有igg-d的重链，但天然存在的igg-d铰链区被含有与seq id no：113的氨基酸序列具有至少90％，95％或100％同一性的氨基酸序列的铰链区取代。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有igg-d的重链，但天然存在的igg-d铰链区被含有与seq id no：114的氨基酸序列具有至少90％，95％或100％同一性的氨基酸序列的铰链区取代。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有igg-d的重链，但天然存在的igg-d铰链区被含有seq id no：115的氨基酸序列的铰链区取代。

16、在组合物的某些实施方案中，针对犬il-31ra的犬源化抗体包含重链和轻链，所述重链包含seq id no：79，seq id no：80或seq id no：81的氨基酸序列，所述轻链包含seqid no：82，seq id no：83，seq id no：84或seq id no：85的氨基酸序列。本发明进一步提供了这些犬源化抗体的抗原结合片段。

17、在特定实施方案中，犬源化抗体包含含有seq id no：84的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：80的氨基酸序列的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq idno：84的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：81的氨基酸序列的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq id no：84的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：79的氨基酸序列的重链。

18、在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq id no：85的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：80的氨基酸序列的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq idno：85的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：81的氨基酸序列的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq id no：85的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：79的氨基酸序列的重链。

19、在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq id no：83的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：80的氨基酸序列的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq idno：83的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：81的氨基酸序列的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq id no：83的氨基酸序列的轻链和含有seq idno：79的氨基酸序列的重链。

20、在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq id no：82的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：80的氨基酸序列的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq idno：82的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：81的氨基酸序列的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有seq id no：82的氨基酸序列的轻链和含有seq id no：79的氨基酸序列的重链。

21、在具体的实施方案中，当与犬il-31ra结合时，哺乳动物抗体(例如犬源化抗体)结合seq id no：97或seq id no：103的氨基酸所包含的表位，或结合seq id no：97和seq idno：103两者所包含的表位。在特定的实施方案中，表位的鉴定基于化学交联和质谱检测。在相关的实施方案中，当与犬il-31ra结合时，哺乳动物抗体结合seq id no：97或seq id no：103的氨基酸序列内，或seq id no：97和seq id no：103二者内的至少一个氨基酸残基，优选1-3个氨基酸残基，更优选2-5个氨基酸残基，和/或更优选3-8个氨基酸残基或更多。

22、在特定的实施方案中，结合seq id no：97的哺乳动物抗体结合seq id no.2的94位的酪氨酸残基，即y94。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的102位赖氨酸残基，即k102。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的112位赖氨酸残基，即k112。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的94位的酪氨酸残基和seq idno.2的102位的赖氨酸残基。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的102位的赖氨酸残基和seq id no.2的112位的赖氨酸残基。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的94位的酪氨酸残基和seq id no.2的112位的赖氨酸残基。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合94位的酪氨酸残基，结合seq id no.2的102位的赖氨酸残基和seqid no.2的112位的赖氨酸残基。

23、在相关的实施方案中，结合seq id no：103的哺乳动物抗体结合seq id no.2的183位的精氨酸残基，即r183。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的193位的丝氨酸残基，即s193。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的202位苏氨酸残基，即t202。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的183位的精氨酸残基和seqid no.2的193位的丝氨酸残基。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的193位的丝氨酸残基和seq id no.2的202位的苏氨酸残基。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的183位的精氨酸残基和seq id no.2的202位的苏氨酸残基。在其它实施方案中，哺乳动物抗体结合seq id no.2的183位的精氨酸残基，结合seq id no.2的193位的丝氨酸残基和seq id no.2的202位的苏氨酸残基。本发明进一步提供这些哺乳动物抗体的抗原结合片段。

24、本发明还提供了编码以下任何的核酸，包括分离的核酸：3个hcdrs或3个lcdrs的集合；犬源化抗体或其抗原结合片段的重链可变区；犬源化抗体或其抗原结合片段的重链，犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链可变区，和/或犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链。本发明还提供了一对核酸，其中该对核酸中的一个包含编码本发明的任一种抗体的特异性犬源化抗体的轻链的核苷酸序列，且该对核酸中的另一个包含编码该(所述)特异性犬源化抗体的重链的核苷酸序列。本发明还提供了包含这样的核酸对或本发明的单个核酸的表达载体。此外，本发明提供了表达载体对，其中所述表达载体对中的一个包含含有编码本发明抗体中的任一种的特异性犬源化抗体的轻链的核苷酸序列的核酸，并且所述表达载体对中的另一个包含含有编码该(所述)特异性犬源化抗体的重链的核苷酸序列的核酸。

25、因此，本发明进一步提供了编码本发明的哺乳动物抗体(包括犬源化抗体)的三个重链互补决定区(cdr)cdr重链1(hcdr1)、cdr重链2(hcdr2)和cdr重链3(hcdr3)的集合的核酸。在更具体的实施方案中，所述核酸编码包含seq id no：3的氨基酸序列的hcdr1；包含seq id no：10，seq id no：11，seq id no：12，或seq id no：13的氨基酸序列的hcdr2；以及包含seq id no：20，seq id no：21，seq id no：22，或seq id no：23的氨基酸序列的hcdr3；或其任何组合。

26、本发明还提供了编码本发明的哺乳动物抗体(包括犬源化抗体)或其抗原结合片段的三个轻链互补决定区(cdr)、cdr轻链1(lcdr1)、cdr轻链2(lcdr2)和cdr轻链3(lcdr3)的集合的核酸。在此类型的更具体实施方案中，所述核酸编码包含seq id no：30或seq idno：31的氨基酸序列的lcdr1；包含seq id no：38，seq id no：39或seq id no：40的氨基酸序列的lcdr2；以及包含seq id no：45的氨基酸序列的lcdr3；或其任何组合。

27、本发明还提供了编码本发明的哺乳动物抗体(包括犬源化抗体)或其抗原结合片段的任何重链的核酸。本发明还提供了编码本发明的哺乳动物抗体(包括犬源化抗体)或其抗原结合片段的任何轻链的核酸。此外，本发明提供了包含并能够表达本发明的一种或多种核酸的表达载体，以及包含一种或多种这样的表达载体的宿主细胞。

28、本发明还提供了包含本发明的犬源化抗体及其抗原结合片段以及药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的核酸以及药学上可接受的载体和/或稀释剂，和/或包含一种或多种本发明的核酸以及药学上可接受的载体和/或稀释剂的表达载体。

29、本发明还提供了治疗特应性皮炎的方法，其包括向患有特应性皮炎的动物受试者施用上述药物组合物中的一种。在特定实施方案中，动物对象是犬科动物。本发明还提供了在动物受试者中帮助阻断与特应性皮炎相关的瘙痒的方法，包括向有此需要的动物受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在特定实施方案中，动物对象是犬科动物。

30、此外，本发明提供了产生结合犬il-31ra的犬源化抗体或其抗原结合片段的方法。在特定实施方案中，该方法包括在表达核酸的条件下在培养基中培养包含编码和表达本发明的犬源化抗体的轻链和该犬源化抗体的重链的一种或多种表达载体的宿主细胞，从而产生包含本发明的犬源化抗体的轻链和/或该犬源化抗体的重链的多肽。然后从宿主细胞或培养基中回收多肽。在某些实施方案中，包含本发明的犬源化抗体的轻链的多肽和包含该犬源化抗体的重链的多肽各自在有益于形成犬源化抗体的条件下组合。

31、通过参考以下附图的简要描述和详细描述，将更好地理解本发明的这些和其它方面。