一种发酵生产聚谷氨酸的工艺的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种发酵生产聚谷氨酸的工艺。

背景技术：

1、聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-pga)是在一些特定的微生物中发现的天然聚氨基酸,是一种由谷氨酸通过γ-酰胺键连接聚合而成的多功能肽,目前可以通过微生物发酵实现规模制备。γ-pga的羧基可与羟基结合，安全无毒，具有优良的水溶性、保湿型、吸附性、缓释性、抗冻性等多种生物学特性，可作为保湿剂、絮凝剂、冻干保护剂、药物载体、缓释剂以及医药敷料等应用于多种领域，产生巨大的社会效益和商业应用价值。γ-pga具有极强的水溶性、可生物降解性、生物相容性、安全无毒、可食用和环境友好的生物学特性，被广泛应用于农业、环境保护、医药、食品、工业和化妆品等领域，是一种较为理想的新型生物材料，拥有巨大的应用前景及经济价值，近年来引起越来越多的国内外研究人员的关注。

2、产生γ-pga的菌株根据生物聚合物生产对l-谷氨酸的需求分为两类：l-谷氨酸依赖性和非依赖性菌株。依赖于l-谷氨酸的菌株，在其培养基中添加前体物l-谷氨酸能够高水平地生物合成γ-pga。由于非依赖性菌株发酵γ-pga产量不高，当前市场上主要利用l-谷氨酸依赖性菌株进行γ-pga生产。在获得高产菌株的前提下，通过优化发酵培养基（如碳源、氮源、无机盐等）、优化发酵条件（如温度、p h值、溶氧等）、选择合适的发酵方式（如分批发酵、连续发酵、分批补料发酵等）是提高γ-pga产量的重要手段。

3、中国专利“cn110669798a，农用低成本聚谷氨酸的生产方法”，针对特定枯草芽孢杆菌cgmcc no.2108，通过发酵培养基中添加壳聚糖和氯化钠，来改变细胞壁的通透性，促进聚谷氨酸分泌到胞外，提高了聚谷氨酸的产量。

4、中国专利“cn116144532a,一种高效制备农业用γ-聚谷氨酸的方法”,采用紫外诱变技术进行诱变，经过24代诱变得到变异菌株枯草芽孢杆菌pga2020-10,较出发菌株的发酵产量提高了16%,并且能够高效利用甘油发酵产聚谷氨酸。

5、文献“添加物对枯草芽胞杆菌γ-聚谷氨酸合成代谢的影响，生物加工工程2010年”对枯草芽孢杆菌hcul-b115代谢网络和发酵特性研究的基础上,通过添加适量的氨基酸、有机酸和维生素对聚γ谷氨酸发酵进行合成代谢进行研究。结果发现，l-谷氨酸、l-苯丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬氨酸、l-缬氨酸、延胡索酸、草酸、丙二酸、烟酸和抗坏血酸等添加物对菌株hcul-b115合成聚γ谷氨酸有明显促进作用。该菌株属于非l-谷氨酸依赖性菌株，自身能够大量合成谷氨酸。通过加入l-缬氨酸和l-苯丙氨酸使代谢流向丙酮酸方向，从而胞内有较多的丙酮酸进入tca循环，增加了l谷氨酸的积累，从而使得聚谷氨酸合成增加。

6、聚谷氨酸的发酵研究还相对较少，如何提高聚谷氨酸的发酵产酸量是需要不断探索的技术问题。

技术实现思路

1、在cn116144532a的基础上，继续研究和优化pga2020-10的发酵能力，从而增加聚谷氨酸的发酵产量。

2、本发明是通过如下技术方案来实现的。

3、一种发酵生产聚谷氨酸的工艺，其包括如下步骤：

4、将枯草芽孢杆菌二级种子液按1-5%的接种量转入到发酵培养基中培养，通过流加葡萄糖溶液控制还原糖浓度不低于0.5%，流加氨水调节ph值至7.0，培养时间36h，得到聚谷氨酸发酵液；

5、所述发酵培养基的组分为：葡萄糖40g/l、玉米浆20g/l、酵母膏10g/l、谷氨酸钠50g/l、硫酸铵6g/l、甘油5g/l、d-苯丙氨酸4g/l、磷酸二氢钾0.2g/l、磷酸氢二钾0.2g/l、七水硫酸镁0.1g/l、七水硫酸亚铁1mg/l，溶剂为水。

6、优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖40g/l、玉米浆20g/l、酵母膏10g/l、谷氨酸钠 50g/l、氯化钠40g/l、硫酸铵6g/l、甘油5g/l、d-苯丙氨酸4g/l、磷酸二氢钾0.2g/l、磷酸氢二钾0.2g/l、七水硫酸镁0.1g/l、七水硫酸亚铁1mg/l，溶剂为水。

7、优选地，所述培养条件为：ph值7.0，温度37℃，压力0.05mpa，溶氧控制在10%。

8、进一步地，所述枯草芽孢杆菌二级种子液的制备方法包括：

9、1）将枯草芽孢杆菌pga2020-10（cgmcc no.23581）进行活化，接种于斜面种子培养基，置于恒温箱中37℃培养48h；

10、2）无菌条件下，将斜面菌种接种到一级种子培养基中，37℃培养24h，得到一级种子液；

11、3）将一级种子液按照12%的接种量接入到二级种子培养基中，37℃振荡培养至od600值为4，得到二级种子液。

12、具体地，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌pga2020-10。

13、优选地，所述斜面种子培养基组分为：蛋白胨10g/l、酵母膏2g/l、葡萄糖5g/l、氯化钠5g/l、琼脂20g/l、磷酸二氢钾1g/l，ph控制在7.0。

14、优选地，所述一级种子培养基和二级种子培养基组分均为：葡萄糖30g/l、玉米浆10g/l、酵母膏10g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钾0.5g/l；ph控制在7.0。

15、本发明取得的有益效果主要包括以下几个方面：

16、聚谷氨酸的合成和分泌受细胞通透性和外排等多方面因素的影响，本发明通过研究d-苯丙氨酸、氯化钠、三氯化铁三种组分对pga2020-10发酵能力的影响，发现d-苯丙氨酸、三氯化铁能够提高pga2020-10合成聚谷氨酸的能力，氯化钠影响较小。d-苯丙氨酸联合氯化钠使用明显优于单独使用d-苯丙氨酸，二者具备一定的协同作用，d-苯丙氨酸和三氯化铁联合使用并不能达到相互促进的技术效果。

技术特征：

1.一种发酵生产聚谷氨酸的工艺，其包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖40g/l、玉米浆20g/l、酵母膏10g/l、谷氨酸钠 50g/l、氯化钠40g/l、硫酸铵6g/l、甘油5g/l、d-苯丙氨酸4g/l、磷酸二氢钾0.2g/l、磷酸氢二钾0.2g/l、七水硫酸镁0.1g/l、七水硫酸亚铁1mg/l，溶剂为水。

3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述培养条件为：温度37℃，压力0.05mpa，溶氧控制在10%。

4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌二级种子液的制备方法包括：

5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌pga2020-10，保藏号为cgmcc no.23581。

6.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述斜面种子培养基组分为：蛋白胨10g/l、酵母膏2g/l、葡萄糖5g/l、氯化钠5g/l、琼脂20g/l、磷酸二氢钾1g/l，ph控制在7.0。

7.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述一级种子培养基和二级种子培养基组分均为：葡萄糖30g/l、玉米浆10g/l、酵母膏10g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钾0.5g/l；ph控制在7.0。

技术总结本发明属于生物发酵技术领域，公开了一种发酵生产聚谷氨酸的工艺，其包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌二级种子液按1‑5%的接种量转入到发酵培养基中培养36h，得到聚谷氨酸发酵液；发酵培养基的组分为：葡萄糖40g/L、玉米浆20g/L、酵母膏10g/L、谷氨酸钠50g/L、硫酸铵6g/L、甘油5g/L、D‑苯丙氨酸4g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、七水硫酸镁0.1g/L、七水硫酸亚铁1mg/L。本发明通过优化发酵培养基组分，提高了聚谷氨酸合成效率。本发明还采用谷氨酸提取废水替换发酵培养基用水，利用了废水中残余的谷氨酸，提高了谷氨酸提取废水的综合效益。技术研发人员：董力青,边恩来,时夫龙,吕宝龙,张启隆,伏广好,王建文,王志远,祝咸达,郑嘉嘉受保护的技术使用者：内蒙古阜丰生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4