一种鉴别日本甜柿基因型的方法及其应用

本发明涉及基因型鉴别，尤其是涉及一种鉴别日本甜柿基因型的方法及其应用。

背景技术：

1、柿(diospyros kaki thunb.，2n＝6x＝90；少数品种2n＝9x＝135)原产我国，是柿属植物中作为果树栽培的代表种，其传统产区在中国、韩国和日本等东亚地区。根据柿成熟期果实能否自然脱涩及其性状遗传特点，柿品种分为甜涩性状表现质量性状遗传的完全甜柿(pollination-constant and non-astringent,pcna)和数量性状遗传的非完全甜柿(non-pcna)。

2、完全甜柿成熟时可在树上自然脱涩，不需脱涩处理即可脆食，其质地类似于苹果。非完全甜柿则在成熟后仍需经人工脱涩处理后才可鲜食。人工脱涩不仅会增加生产成本，且脱涩后的果实易软化、运输不便，脱涩不完全更影响产品的商品性。因此，完全甜柿更受消费者青睐，具有较高的育种价值。完全甜柿可细分为自然脱涩性状受显性基因(cpcna)控制的中国原产完全甜柿(简称“中国甜柿”或“c-pcna”)和受隐性基因(ast)控制的日本原产完全甜柿(简称“日本甜柿”或“j-pcna”)。

3、鉴别日本甜柿的基因型，能为杂交亲本的选择提供参考，而且将基因型用于幼株的胚拯救、嫩枝高接和标记辅助选择的杂交组合，将大大提高日本甜柿育种的效率，对育成具知识产权的完全甜柿新品种具有重要意义。

4、目前，在实际应用中，日本甜柿自然脱涩基因的数量鉴别，依赖于sybr green i荧光染料能与双链dna非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中sybr greeni的荧光强度，达到检测qpcr产物扩增量的目的，但在实际应用中，引物存在非特异性结合，qpcr反应中非特异性扩增产物的出现会增加荧光值，进而影响定量结果的准确性，使不同标准曲线得出的结果存在一定差距，对于部分材料没办法得出完全准确的结果；此外，这种方法必须利用三条参考基因的标准曲线才能确定待测材料的基因型，试剂、材料耗费较大；原程序需要经过完整的pcr反应结合双链后检测荧光信号，时间耗费较长，资金和时间成本均较高。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种鉴别日本甜柿基因型的方法及其应用，以解决目前日本甜柿基因型鉴别方法具有偏好性，对于部分柿材料的检测结果稳定性差、可靠性低，且耗时长、工作量大的问题，提供一种新的、高效的鉴别方法，为选育以日本甜柿为亲本的杂交后代提供准确的基因型参考。

2、为实现上述目的，本发明提供一种鉴定日本甜柿基因型的方法，包括以下步骤：

3、s1、提取日本甜柿标准样品的基因组dna，根据日本甜柿自然脱涩位点ast区间、参考基因设计特异性引物和taqman特异探针，将特异性引物和taqman特异探针送公司合成；

4、s2、将获得的日本甜柿标准样品的基因组dna倍比稀释成不同的浓度，然后分别与日本甜柿自然脱涩位点ast区间、参考基因特异性引物和taqman特异探针混合进行实时荧光定量pcr反应，得到不同dna浓度下的ct值；

5、s3、利用得到的日本甜柿标准样品不同dna浓度、不同特异性引物和taqman特异探针下的ct值，建立标准曲线；

6、s4、提取待测柿材料的基因组dna，并稀释成确定浓度，分别与日本甜柿自然脱涩位点ast区间、参考基因特异性引物和taqman特异探针混合后进行实时荧光定量pcr反应，获得不同特异性引物和taqman特异探针下的ct值，将获得的ct值分别代入s3建立的标准曲线中，即可计算得到待测柿材料的基因型。

7、优选的，所述s1中日本甜柿标准样品为‘太秋’，参考基因为dkact、l5r；日本甜柿自然脱涩位点ast区间特异性引物的上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示，taqman特异探针的序列如seq id no.3所示。

8、优选的，所述s1中dkact基因的特异性引物的上游引物序列如seq id no.4所示，下游引物序列如seq id no.5所示，taqman特异探针序列如seq id no.6所示；l5r基因的特异性引物的上游序列如seq id no.7所示，下游引物序列如seq id no.8所示，taqman特异探针序列如seq id no.9所示。

9、优选的，所述s2中基因组dna倍比稀释成不同的浓度指：最大浓度为120ng·μl-1，依次进行两倍稀释，共设置八个dna浓度梯度；s3中建立的标准曲线包括日本甜柿自然脱涩位点ast区间和参考基因的标准曲线。

10、优选的，所述s4中计算待测柿材料基因型，采用以下公式进行：

11、ast相对等位基因剂量＝ast的相对dna用量/参考基因的相对dna用量×6；

12、式中，ast的相对dna用量为：将待测柿材料利用日本甜柿自然脱涩位点ast特异性引物、taqman特异探针，进行实时荧光定量pcr得到的ct值，代入日本甜柿自然脱涩位点ast区间标准曲线计算得到的数值；

13、参考基因的相对dna用量为：将待测柿材料利用参考基因特异引物与taqman特异探针，进行实时荧光定量pcr得到的ct值，代入参考基因标准曲线计算得到的数值。

14、优选的，当ast相对等位基因剂量小于0.5时，待测柿材料的基因型为aaaaaa；当ast相对等位基因剂量大于等于0.5小于1.5时，待测柿材料的基因型为aaaaaa；当ast相对等位基因剂量大于等于1.5小于2.5时，待测柿材料的基因型为aaaaaa；当ast相对等位基因剂量大于等于2.5小于3.5时，待测柿材料的基因型为aaaaaa；依此类推，当ast相对等位基因剂量大于等于5.5小于6.5时，待测柿材料的基因型为aaaaaa。

15、优选的，所述s4中待测柿材料基因组dna的浓度为60ng·μl-1，日本甜柿自然脱涩位点ast区间、参考基因特异性引物和taqman特异探针的浓度与s2中的浓度相同。

16、优选的，所述s2和s4中进行实时荧光定量pcr的体系为：5μl probe qpcr mixmultiplus、0.1μl的rox reference dyeⅱfor rr393、10μm/l的上游引物和下游引物各0.2μl、0.1μm/lprobe 0.25μl、基因组dna模板1μl，ddh2o补至10μl。

17、优选的，所述s2和s4中先将基因组dna于95℃变性10min，再与日本甜柿自然脱涩位点ast区间、参考基因特异性引物和taqman特异探针混合，进行实时荧光定量pcr的程序为：25℃2min，95℃预变性20s为第一步，一个循环；95℃1s，60℃20s，为第二步，40个循环，第二步中每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

18、一种如上所述的鉴别日本甜柿基因型的方法在日本甜柿基因型鉴别中的应用。

19、因此，本发明提供的一种鉴别日本甜柿基因型的方法及其应用，其具体技术效果如下：

20、(1)本发明提供的鉴别日本甜柿基因型的方法，通过探针与目标分子之间发生特异性的水解反应方可生成荧光信号，误差更小，鉴别结果更准确，结果稳定性更高；

21、(2)本发明提供的鉴别日本甜柿基因型的方法，只需要两个参考基因组，鉴定易操作，可以大幅降低日本甜柿基因型鉴别的工作量，试剂耗材等的消耗更少，鉴别成本更低；

22、(3)本发明提供的鉴别日本甜柿基因型的方法，可以大幅缩短鉴别所需时间，提高鉴别效率，对日本甜柿种质资源及杂交后代的基因型鉴定具有重要意义，可以为甜柿品种改良和育种提供有力的技术支持。

23、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。