一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测麦角病菌的引物、试剂盒及检测方法

本发明属于植物病原菌检测，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a检测麦角病菌的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、麦角病是由麦角菌clavicepspurpurea引起的一种严重危害小麦的病害，被侵染的小花会分泌含有大量分生孢子的黄色蜜露状黏液，随后形成坚硬的、紫黑色、长约0.2～0.5厘米的角状组织，即为菌核(麦角)。麦角菌不仅会导致小麦大幅减产，其产生的麦角生物碱，如麦角碱(ergostine)、麦角胺(ergotamine)和麦碱(ergine)等，具有高度毒性，人或牲畜误食含有麦角的粮食或饲料，可引发坏疽性和痉挛性麦角中毒。我国进口小麦的主要来源地如美国、加拿大、澳大利亚等均为麦角病的流行区。根据国家标准gb2715-2006《食品安全国家标准粮食》规定，小麦中麦角的检出限量为0.01％，而在大米、玉米、豆类中则不得检出。然而，全国各口岸多次出现进口小麦中麦角超标问题，毗邻我国的中亚和东亚国家已有麦角菌分布信息，2022年我国云南小麦中首次发现了麦角病。该病对小麦生产构成潜在威胁，因此开发快速、灵敏的病原菌检测技术对于麦角病的监测至关重要。

2、目前，常用的病原菌鉴定方法主要有传统鉴定方法和分子鉴定方法。传统鉴定方法如柯赫氏法则等检测和诊断过程周期长、工作量大、结果有误差。随着分子检测技术的发展和更新，新的恒温扩增技术如lamp及rpa等极大地简化了检测的操作流程，并降低了设备要求；在crispr基因编辑系统中，cas12a蛋白在指导rna的引导下切割靶标dna，激活其侧向裂解活性，从而无差别地裂解周围单链dna报告探针，该技术可作为dna核酸检测工具。然而，目前这种技术尚未应用于麦角病菌的快速检测中。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种基于rpa-crispr/cas12a检测麦角病菌的引物、试剂盒及检测方法，该方法具有用时短、特异性强、灵敏度高、结果准确等优点。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

3、一种基于rpa-crispr/cas12a检测麦角病菌的引物，所述麦角病菌的拉丁学名为clavicepspurpurea，所述检测麦角病菌的引物包括rpa上游引物、rpa下游引物和crrna引物及通用引物，

4、所述rpa上游引物为mj-rpa-f，核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、所述rpa下游引物为mj-rpa-r，核苷酸序列如seq id no.2所示；

6、所述crrna引物为mj-crrna，核苷酸序列如seq id no.3所示；

7、所述通用引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

8、本发明还提供了一种基于rpa-crispr/cas12a检测麦角病菌的试剂盒，该试剂盒包括所述基于rpa-crispr/cas12a检测麦角病菌的引物。

9、优选地，所述试剂盒还包括cas12a蛋白、t7转录酶、dna聚合酶、缓冲液、cas12/13专用核酸检测试纸条。

10、本发明还提供了一种基于rpa-crispr/cas12a检测麦角病菌的方法，包括以下步骤：

11、s1、提取待测样本dna；

12、s2、rpa扩增：利用rpa上、下游引物对s1中提取的待测样本dna在温度为37℃的条件下进行恒温扩增10～20min，得到rpa扩增产物；

13、所述扩增反应体系为：待测样品dna 2μl、10μm的rpa上游引物2μl、10μm的rpa下游引物2μl、反应酶3μl、rapid缓冲液25μl、无酶水补足至50μl；

14、s3、crrna模板的合成：用crrna引物和通用引物进行pcr扩增，得到crrna的dna模板；

15、所述pcr扩增体系为：10×pfu buffer 5μl、dntp mix 4μl、10μm crrna引物3μl、10μm通用引物3μl、4000u/ml pfu dna聚合酶0.25μl、无酶水补足至50μl；所述dntp mix为datp、dgtp、dctp和dutp的混合物，所述datp、dgtp、dctp和dutp的浓度均为2.5mm；

16、所述pcr扩增程序为：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃20s，35个循环；72℃10min；16℃保存；

17、s4、crrna的合成：将s3中得到的crrna的dna模板在温度为37℃的条件下进行体外转录3～4h，合成crrna；

18、所述体外转录合成的反应体系为：200ng/μl crrna的dna模板5μl、40u/μl rnaseinhibitor 1μl、10×transcription buffer 2μl、1000u/ml t7 rna聚合酶2μl、ntp混合物4μl、无酶水补足至20μl；所述ntp混合物为atp、gtp、ctp和utp各1μl；

19、s5、rpa-crispr/cas12a检测体系的建立：使用s2所述的rpa扩增产物和s4中得到的crrna建立rpa-crispr/cas12a检测体系，在温度为37℃的条件下反应5～15min，得到rpa-crispr/cas12a反应产物；

20、所述rpa-crispr/cas12a检测体系为：10×neb cutsmart buffer 6μl、200ng/μlcas12a 6μl、40u/μl rnase inhibitor 1.5μl、4.25ng/μl crrna 18μl、10μm fb探针1.2μl、rpa扩增产物2μl，无酶水补足至60μl；

21、所述fb探针的核苷酸序列如seq id no.5所示，5’端用fam羧基荧光素修饰，3’端用生物素biotin修饰；

22、s6、检测结果的判读：将s5中得到的rpa-crispr/cas12a反应产物用cas12/13专用核酸检测试纸条检测，2～3min后观察所述cas12/13专用核酸检测试纸条检测线的颜色变化：当试纸条检测线(t)出现红色条带、质控线(c)不显色，或质控线(c)和检测线(t)颜色均出现红色条带，则说明cas12/13可以进行有效切割，并激活报告基团显色，结果判定为阳性；当只有质控线(c)出现一条红色条带，检测线(t)不显色，则判定为阴性。

23、本发明由具有以下显著的技术效果：

24、1、特异性强。本发明基于rpa-crispr/cas12a检测麦角病菌的检测体系在目的基因保守区域的特异性片段的特异性位点进行引物设计，可实现麦角病菌的精准、快速鉴定。

25、2、灵敏度高。本发明对麦角病菌的检测灵敏度极高，每个反应可检测低至10个拷贝靶标dna。

26、3、结果准确。本发明通过rpa引物扩增和cas12a/crrna的靶向裂解，确保了检测结果的准确性和可靠性。

27、4、用时短。整个检测技术方法只需要在恒温(37℃)条件下进行，检测流程<1h。

28、5、实用性好。本发明通过一次合成crrna，可长期使用，降低了对仪器设备的要求，结果可直接通过侧流层析试纸条反应来判断，可用于麦角病菌的田间检测和进出口岸检测。

29、下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。