一种改良的CHO-S细胞瞬时转染方法与流程

本发明属于生物工程，具体地涉及一种改良的cho-s细胞瞬时转染方法。

背景技术：

1、生产高达毫克级或克级的重组蛋白是许多科研团队与制药公司在临床前、生化、生物物理和药物研究的基本过程。哺乳动物细胞体系生产重组蛋白由于其具有能最佳的表达高分子量的蛋白质产物、使复杂结构的蛋白产生正确的折叠和给糖蛋白提供合适的翻译后修饰的功能而成为生物制药领域表达重组蛋白的最佳选择。

2、传统的哺乳动物细胞表达体系是构建细胞稳定表达将外源基因整合到宿主细胞染色体上的稳定株表达体系。构建稳定株表达体系生产重组蛋白需要在 dna导入细胞后进行长时间的筛选，然后才能确定表达量高并且稳定的细胞株，这个过程通常需要几个月的时间并且花费大量的人力来完成。

3、cho细胞(chinese hamster ovary cell，l，中国仓鼠卵巢细胞)作为哺乳动物蛋白表达系统，被广泛地用来表达重组dna蛋白。例如cho-s细胞在配套的cho-s表达培养基中具有不成团，不聚集，并可以生长到非常高的细胞密度，通过瞬时转染可以产生更高的蛋白质产量。cho-s细胞瞬时转染允许快速、高产量的瞬时蛋白质生产，允许实验室开发蛋白质生物治疗剂在药物开发过程中从cho表达的蛋白质开始到完成。

4、随着生命科学和生物制药的飞速发展，大量的蛋白被用于基础研究和药物开发，急需一个能在短时间内就能得到重组蛋白的方法。基因瞬时表达应运而生，与稳定株表达体系不同，瞬时转染的外源dna不整合到宿主细胞dna中，其在细胞中的数目通常随着细胞的分裂而减少，因此蛋白表达只能维持几天到十几天的时间，但其优点是能在短短几天之内拿到基因的表达产物，而且其通用性强。然而，相对于构建稳定株表达体系来说，瞬时转染生产重组蛋白存在转染效率低、表达量低的缺点，使得此方法的应用受到较大的限制。此外，常用的cho细胞的瞬时转染方法的转染效率较低，且转染后细胞中目的基因的表达产量较低，不能满足实际需求。因此，如何提高瞬时转染的效率、提高表达量成为日常操作成为亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供一种改良的cho-s细胞瞬时转染方法，该转染方法不仅转染效率高，同时可以获得更高cho-s细胞目的抗体表达量，为蛋白质生物治疗剂的开发提供新思路。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种改良的cho-s细胞瞬时转染方法，包括以下步骤：

3、（1）在瞬时转染的前3天将cho-s细胞传代培养，调整细胞密度至0.35×106cells/ml，将含有一定体积细胞的摇瓶放入摇床中进行培养；

4、（2）瞬时转染当天，对cho-s细胞计数，并用新配制的转染培养基稀释调整细胞密度为4×106-6×106cells/ml，检测细胞活率在97％以上，得到cho-s细胞悬液；

5、（3）转染前，将配置好的a液与b液，混匀后静置一段时间，得到混合滴液；

6、（4）将步骤（3）所述混合滴液加入到cho-s细胞悬液中，按照细胞培养条件进行培养，得到重组cho-s细胞。

7、进一步地，上述技术方案步骤（1）中，传代培养基为添加有4mmol/l谷氨酰胺的mirus chogro expression medium；所述细胞传代培养的条件为温度37℃，co2浓度8％，摇床速度125 rpm。

8、进一步地，上述技术方案步骤（2）中，所述转染培养基为添加有4mmol/l谷氨酰胺的90%mirus chogro expression medium与10% gibco®freestyle™ cho expressionmedium的混合物。

9、进一步地，上述技术方案步骤（3）中，所述a液为含抗体轻重链的质粒溶于nacl缓冲液的溶液，所述b液为pei转染试剂溶于nacl缓冲液的溶液；所述混合滴液中质粒与pei转染试剂的质量比为1:3；所述含抗体轻重链的质粒为含抗体轻链质粒与含抗体重链质粒的质量比为6:4的混合物；静置温度为25-37℃，时间为5-20min。

10、进一步地，上述技术方案中，所述抗体轻重链的质粒的总质量与所述cho-s细胞悬液的细胞数量比为0.5-1μg:1×106cells。

11、进一步地，上述技术方案步骤（4）中，所述cho-s细胞悬液中总质粒的浓度为3-4μg/ml；细胞培养条件为：置于摇床培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为8％，摇床速度为125rpm，转染时间为48-72h。

12、本发明还提供一种由上述改良的cho-s细胞瞬时转染方法制得的重组cho-s细胞。

13、本发明还提供一种促进cho-s细胞的瞬时转染后抗体表达的方法，将上述瞬时转染后得到的重组cho-s细胞，在转染后18-20h加入丁酸钠溶液和en3溶液继续培养，促进转染细胞的蛋白表达。

14、进一步地，上述技术方案中，所述丁酸钠溶液为以pbs缓冲液作为溶剂的浓度为100mm的无菌溶液，其添加量为每毫升转染液加入25μl；所述en3溶液为每l无血清1640培养基中溶解29.2g谷氨酰胺和200g葡萄糖后的无菌溶液，其添加量为每毫升转染液加入50μl。

15、本发明还提供一种如上述改良的cho-s细胞瞬时转染方法制得重组cho-s细胞在重组蛋白表达中的应用。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果：

17、本发明通过控制cho-s细胞悬液细胞数量、优化转染试剂比、转染时间及转染培养基组分，转染效率高，可以获得更高cho-s细胞目的蛋白表达量；同时在转染后的一定时间加入一定量的水解物等促进转染细胞后的抗体表达。相对于传统的转染方法，通过采用上述方法可以获得更高cho-s细胞目的蛋白表达量，为蛋白质生物治疗剂的开发提供新思路。

技术特征：

1.一种改良的cho-s细胞瞬时转染方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种改良的cho-s细胞瞬时转染方法，其特征在于，步骤（1）中，传代培养基为添加有4mmol/l谷氨酰胺的mirus chogro expression medium；所述细胞传代培养的条件为温度37℃，co2浓度8％，摇床速度125 rpm。

3.根据权利要求1所述的一种改良的cho-s细胞瞬时转染方法，其特征在于，步骤（2）中，所述转染培养基为添加有4mmol/l谷氨酰胺的90%mirus chogro expression medium与10% gibco® freestyle™ cho expression medium的混合物。

4.根据权利要求1所述的一种改良的cho-s细胞瞬时转染方法，其特征在于，步骤（3）中，所述a液为含抗体轻重链的质粒溶于nacl缓冲液的溶液，所述b液为pei转染试剂溶于nacl缓冲液的溶液；所述混合滴液中质粒与pei转染试剂的质量比为1:3；所述含抗体轻重链的质粒为含抗体轻链质粒与含抗体重链质粒的质量比为6:4的混合物；静置温度为25-37℃，时间为5-20min。

5.根据权利要求4所述的一种改良的cho-s细胞瞬时转染方法，其特征在于，所述质粒的总质量与所述cho-s细胞悬液的细胞数量比为0.5-1μg:1×106cells。

6.根据权利要求1所述的一种改良的cho-s细胞瞬时转染方法，其特征在于，步骤（4）中，所述cho-s细胞悬液中总质粒的浓度为3-4μg/ml；细胞培养条件为：置于摇床培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为8％，摇床速度为125rpm，转染时间为48-72h。

7.一种由权利要求1-6任一项所述的改良的cho-s细胞瞬时转染方法制得的重组cho-s细胞。

8.一种促进cho-s细胞的瞬时转染后抗体表达的方法，其特征在于，将权利要求1-6任一项瞬时转染后得到的重组cho-s细胞，在转染后18-20h加入丁酸钠溶液和en3溶液继续培养，促进转染细胞的蛋白表达。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述丁酸钠溶液为以pbs缓冲液作为溶剂的浓度为100mm的无菌溶液，其添加量为每毫升转染液加入25μl；所述en3溶液为每l无血清1640培养基中溶解29.2g谷氨酰胺和200g葡萄糖后的无菌溶液，其添加量为每毫升转染液加入50μl。

10.一种如权利要求1-6任一项所述的改良的cho-s细胞瞬时转染方法制得重组cho-s细胞或权利要求7所述的重组cho-s细胞在重组蛋白表达中的应用。

技术总结本发明属于生物工程技术领域，具体地涉及一种改良的CHO‑S细胞瞬时转染方法，该转染方法包括以下步骤：在瞬时转染的前3天将CHO‑S细胞传代培养，调整细胞密度至0.35×10<supgt;6</supgt;cells/mL并放入摇床中进行培养；瞬时转染当天，将CHO‑S细胞密度调整为4×10<supgt;6</supgt;‑6×10<supgt;6</supgt;cells/mL，得到CHO‑S细胞悬液；转染前，将配置好的A液与B液，混匀后静置得到混合滴液；将混合滴液加入到CHO‑S细胞悬液中进行培养，得到重组CHO‑S细胞。本发明的转染方法不仅转染效率高，同时可以获得更高CHO‑S细胞目的抗体表达量，为蛋白质生物治疗剂的开发提供新思路。技术研发人员：李红良,张鑫,姚新欣,胡宇峰,程旭,操蓉波受保护的技术使用者：赣南创新与转化医学研究院技术研发日：技术公布日：2024/11/4