一种基于电化学联合酶偶联法制备NAD+的方法与流程

本发明属于生物酶工程，具体涉及一种基于电化学联合酶偶联法制备nad+的方法。

背景技术：

1、烟酰胺类化合物(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸nadh/nad+及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸nadph/nadp+)是生物代谢过程中最常见的氧化还原辅酶之一，它们在所有生物体内作为重要的电子受体或者供体，推动生物合成与分解代谢反应，对维持胞内氧化还原动态平衡起着决定性作用。由于其在机体内具有重要的生理意义，常常与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病如神经退行性疾病、糖尿病和癌症的发生密切相关，这也使得它们成为潜在的生物标志物。

2、在生物合成过程中，氧化还原酶是目前工业中应用最广泛的催化剂之一，而几乎所有这类酶都需要辅酶参与电荷传递，包括nad+/nadp+，才能实现催化反应，但因辅酶价格昂贵，大大限制了氧化还原酶的工业应用，因此亟需开发高效经济可行的辅酶再生系统。

3、近年来，研究者们开发了各种方法实现此类辅酶的再生。首先化学法，该方法常通过加入无机盐如nabh4或添加过渡金属配合物如ru、ir及rh催化剂等实现辅酶再生，但这些外源物的引入均会降低酶活性，且过渡金属配合物价格昂贵，一些高活性重金属毒性极高，大大限制了该方法的应用。其次光化学法，其利用廉价且清洁的光能同时，通常需要引入光敏剂，电子媒介物和电子供体，且大部分光敏剂如ru(bpy)3 2+和zn-tmpy4+不稳定，易发生光降解，电子媒介物如mv2+有毒会造成产物污染，且还原性太强而使得酶促合成的产物被还原，因此再生效率较低，有待进一步研究。然后酶法，该方法反应速率快，选择性高，但体系往往涉及两种或两种以上的酶，在反应中需要兼顾所有酶的最适反应条件及副产物带来的各种影响，对体系设计要求较高。最后电化学法，该方法采用由电极产生的电力来提供氧化还原当量实现辅酶再生，相比酶法成本较低，且能实时监测氧化还原电势及反应过程，但它与酶促反应体系的兼容性较差，选择性低，常用于氧化态辅酶的再生。

4、nad(p)h氧化酶(nox)是以nad(p)h辅酶作为底物，依赖黄素类化合物(如fad、fmn等)作为氧化nad(p)h的辅因子，被氧气氧化生成nad+/nadp+，最后形成水或过氧化氢副产物。nox可与脱氢酶形成多酶偶联系统，并用于nad(p)+辅酶再生，但由于nox需要外源氧气分子的参与，不论是鼓泡空气或纯氧引入的方式产生的气液界面效应都会影响酶的稳定性，从而导致nad(p)+氧化态辅酶无法高效可持续合成。从而，基于nox开发高效可行的辅酶再生系统具有重要应用意义。

技术实现思路

1、鉴于传统nad+/nadp+再生方法存在明显的问题，本发明的目的在于通过将电化学和酶催化反应偶联用于氧化态nad+的生物电催化合成；

2、本发明采用计算机辅助设计，对nox氧化酶进行改造，改变其氧气参与反应传统路径，且利用电极超电势作用氧化nad(p)h，开发了一种基于电化学-酶偶联法的无氧工艺实现氧化态nad+的高效可持续合成方法，该电化学-酶偶联法的建立，能在实现fad辅因子重生的同时，也能高效可持续合成nad+，这为进一步实现nad+再生提供前期基础。

3、本发明所采取的技术方案是：

4、本发明的第一方面，提供nox氧化酶突变体，所述nox氧化酶突变体选自如seq idno:1所示的氨基酸序列在第40位、第42位中的至少一个氨基酸处的突变。

5、优选地，如seq id no:1所示的氨基酸序列在第40位突变为色氨酸；如seq id no:1所示的氨基酸序列在第42位突变为甘氨酸或丙氨酸。

6、优选地，所述nox氧化酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2、seq id no:3或seqid no:4所示。

7、本发明的第二方面，提供与本发明第一方面所述的nox氧化酶突变体相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：

8、a1)编码本发明第一方面所述的nox氧化酶突变体的核酸分子；

9、a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；

10、a3)含有a1)所述核酸分子或a2)所述表达盒的重组载体；

11、a4)含有a1)所述核酸分子、a2)所述表达盒或a3)所述重组载体的重组生物细胞。

12、优选地，所述载体包括病毒性载体或非病毒性载体。

13、优选地，所述病毒性载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、痘病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体中的至少一种。

14、优选地，所述非病毒性载体包括：质粒载体、阳离子多聚物载体、壳聚糖、聚乙烯亚胺、纳米颗粒载体、脂质体中的至少一种。

15、优选地，所述的重组表达载体以pet-28a作为原始表达载体。

16、优选地，所述细胞包括原核细胞、真核细胞；所述细胞非植物或动物新品种。

17、优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的细菌。

18、优选地，所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞中的至少一种。

19、本发明的第三方面，提供一种酶电极，所述酶电极包含nox氧化酶、偶联剂、基底电极。

20、优选地，所述基底电极包括但不限于玻碳电极，可以为任何一种能负载上电极溶液的电极，如碳布、碳纸、泡沫镍和泡沫铜等。

21、优选地，所述nox氧化酶包括野生型nox氧化酶或nox氧化酶突变体，所述nox氧化酶突变体包括本发明第一方面所述的nox氧化酶突变体，还包括任何一种能降低氧气分子干扰的nox的突变体；所述野生型nox氧化酶包括但不限于肠膜明串珠菌来源的lmnox，也可以为任何一种产水型nox氧化酶，如变形链球菌来源的smnox，旧金山乳杆菌来源的lsnox及贝利维乳酸菌来源的lbnox等。

22、优选地，所述偶联剂包括但不限于壳聚糖(cts)，可以为任何一种粘结剂如萘酚、戊二醛、聚乙烯亚胺和/或聚二烯二甲基氯化铵用作交联固定。

23、本发明的第四方面，提供本发明第三方面所述酶电极的制备方法，包括以下步骤：将偶联剂、nox氧化酶混合均匀形成复合溶液，将复合溶液置于基底电极表面，形成酶电极。

24、优选地，所述复合溶液中偶联剂的终浓度为0.1～0.5％。

25、优选地，所述复合溶液中nox氧化酶的终浓度为5～25mg/ml。

26、优选地，混合的条件为2～6℃搅拌15～30min。通过混合进行孵育，可以使得nox氧化酶嵌入偶联剂溶液，形成偶联剂固定nox氧化酶的复合材料。

27、优选地，将所述复合溶液涂覆在基底电极表面，固化后，形成酶电极。

28、优选地，所述复合溶液的在基体电极表面的用量为0.05ml/cm2～0.1ml/cm2。

29、本发明的第六方面，提供一种用于酶电化学反应器，所述酶电化学反应器采用三电极体系，以本发明第三方面所述的酶电极为工作电极。

30、优选地，所述三电极体系中的参比电极选自饱和甘汞电极、银|氯化银电极或汞|氧化汞电极；对电极为铂丝电极或碳电极；所述碳电极包括但不限于石墨电极。

31、优选地，所述酶电化学反应器还包括电解池、电解质溶液。

32、优选地，所述电解质溶液中包括底物、电子中介体。

33、优选地，所述电子介体包括但不限于二茂铁甲酸fcca或其衍生物，可以为任何一种能适宜电位且能再生fad的小分子化合物或蛋白，如萘醌类或其衍生物、甲苯胺蓝tbo或血红素等。

34、优选地，所述二茂铁甲酸fcca的衍生物如二茂铁乙酸和二茂铁丙酸等。

35、优选地，所述萘醌类及其衍生物，如萘-1,2-二酮/二醇、萘-1,4-二酮/二醇、苯醌/氢醌及吩嗪-1-羧酸等。

36、优选地，所述底物包括nad(p)h。

37、优选地，所述电化学反应器中电解池使用质子交换膜将阳极室和阴极室分隔开。

38、优选地，所述电解质中电子中介体的浓度为0.2～0.8mg ml-1。

39、优选地，所述电解质中底物的浓度为2～30mg ml-1。

40、优选地，所述电解质的基础溶液包括但不限于pbs缓冲液。

41、本发明的第七方面，提供一种制备nad(p)+的方法，具体为采用本发明第六方面所述的电化学反应器进行反应制备nad(p)+。

42、其中，若nox氧化酶的底物为nadph，通过本发明第六方面所述的电化学反应器进行反应制备nadp+；若nox氧化酶的底物为nadh，则通过本发明第六方面所述的电化学反应器进行反应制备nad+；有些产水型nox(如lsnox)的底物是nad和nadph，则通过本发明第六方面所述的电化学反应器进行反应制备nad+和nadp+。

43、优选地，循环伏安法的方式进行反应；所述循环伏安法的电位扫描速率为50～150mv/s；反应前充入高纯度氩气；所述循环伏安法的扫描范围为-0.7～+0.8v(vs.sce)。

44、本发明的有益效果是：

45、本发明借助于计算机辅助设计改造获得受氧气分子影响较小的nox氧化酶突变体及其相关生物材料，并基于nox氧化酶提供了一种基于电化学-酶偶联法实现氧化态辅酶nad(p)+的高效可持续合成方法；鉴于nox氧化酶是一种强烈依赖于氧气分子和辅因子参与质子传递才能完成催化反应的酶类，首先利用电化学的电极电势简单可控的优点氧化nad(p)h，同时借助于计算机辅助设计nox并改变其氧气参与反应路径，使得在完成整个催化过程中，可以避免氧气参与带来的诸多影响，在再生fad辅因子的同时，也能实现氧化态nad(p)+的高效可持续合成。

46、本方法的本质涉及活性位点中fad辅因子氧化形式的电化学再生，消除了天然lmnox功能的o2依赖性第二半反应，因此不需要在生物合成反应器中鼓泡空气或纯氧。该系统具有无需氧气参与，氧气界面干扰小、持续可控等优点；为进一步辅酶再生提供了重要基础支撑。